红掌(Anthurium andraeanum)为天南星科多年生常绿草本植物。其株形优雅,花型独特,花色艳丽,花期长,盆栽切花两用,是仅次于热带兰的第二大热带花卉商品。但在红掌大规模生产过程中,细菌性叶斑病时有发生,一旦发生很难用药物防治,是阻碍红掌产业发展的因素之一。因此,开展红掌抗病及抗病品种培育的研究对红掌产业的发展具有重大意义。本研究室前期构建了含抗菌肽基因AaAMP的中间表达载体,并转化获得工程农杆菌。在此基础上,本文就红掌离体培养再生体系、农杆菌介导的遗传转化体系及抗菌肽基因AaAMP等方面进行了研究,取得以下结果。1、为进一步优化红掌离体培养再生体系,首先以红掌品种’阿拉巴马’无菌苗为供试材料,探讨了无菌苗不同部位外植体对愈伤组织诱导的影响。结果表明带叶茎段为诱导愈伤组织的最佳外植体,接种60 d时出愈率可达100%,愈伤组织块平均大小为14.3 mm。其次,以不同品种红掌带叶茎段为外植体,探讨愈伤组织诱导的品种间差异。结果显示供试的6个品种接种60 d时出愈率均在70%以上,其中’雅利红’、’特伦萨’、’粉冠军’三个品种与’阿拉巴马’一样,出愈率均达到了 100%,说明采用红掌无菌苗带叶茎段为外植体诱导愈伤组织适用于多数红掌品种。第三,以红掌品种’阿拉巴马’愈伤组织为材料,探讨了不同细胞分裂素种类(6-BA、ZT、TDZ)及浓度对愈伤组织再分化的影响。结果表明在ZT浓度为0.5 mg/L时愈伤组织分化效果较好,继代培养60 d时不定芽分化率可达93.3%,且不定芽形态正常,长势健壮。2、为了检测供试农杆菌的侵染活性与抗菌肽基因AaAMP的表达特性。首先,应用农杆菌介导的瞬时转化技术对烟草叶片及红掌愈伤组织进行了转化试验。结果显示经Gus组织化学染色后,两种组织内均有明显的蓝色斑块出现,说明供试的农杆菌菌株具有较强的侵染活力,外源基因可在植物体内正常表达,显示其生物学功能。其次,将含有抗菌肽基因AaAMP的原核表达菌株大肠杆菌BL21进行IPTG诱导培养。结果显示目的基因能够顺利表达,培养至2 h、4h、6h、8h时,在6.5～9.5 KD之间均出现一条与目的蛋白大小相符的条带。经QE鉴定,目标蛋白条带中检测到抗菌肽蛋白。将原核表达菌株破碎后进行离体抑菌试验,结果显示破碎后的菌株具有一定的抑菌效应。3、为了检测目的基因在植物体内的表达及生物学功能,以哥伦比亚野生型拟南芥(columbia-0)为材料,使用花序侵染法实现目的基因对拟南芥的转化,经多代筛选后获得了 T3代拟南芥。转基因拟南芥经Gus组织化学染色及PCR检测后显示目的基因AaAMP已经转入拟南芥。通过RT-PCR检测,目的基因在转基因拟南芥能够正常转录,但转基因拟南芥植株细胞破碎后进行离体抑菌试验,结果显示转基因拟南芥细胞粗液没有发现抑菌作用。4、为进一步优化红掌遗传转化体系,探讨了红掌无菌苗外植体类型等因素对遗传转化效率的影响。结果显示在无菌苗叶片、叶柄、茎段及带叶茎段4种受体材料中,茎段的转化效果较好,在抑菌培养60 d时出愈率为60%,筛选培养60d时愈伤组织存活率为26.67%。其次,共培养后,经不同时间(2～6周)抑菌培养的愈伤组织再转入筛选培养基。结果发现抑菌培养4周的效果较好,筛选培养60 d时愈伤组织存活率仍可达17.36%。第三,受体愈伤组织经不同方式的农杆菌侵染处理,结果发现愈伤组织划伤处理的转化效果较好,培养30 d时愈伤组织相对生长量最大,筛选培养60 d时存活率为52.56%。第四,在转化试验的不同阶段培养基中加入不同浓度的抗坏血酸(15～45 mg/L)。结果显示加入30 mg/L抗坏血酸的转化效果较好,筛选培养60 d时愈伤组织存活率为35.6%,显著高于其他区,可能是通过减轻受体材料的褐化程度而提高了转化率。5、在优化遗传转化体系的基础上,以红掌愈伤组织为受体材料进行转AaAMP基因试验。得到总转化率(PCR阳性)为3.5%,并筛选获得50个抗性愈伤组织及17株抗性无菌苗。PCR结果显示18个抗性愈伤组织及3株抗性无菌苗扩增出目的条带,表明目的基因AaAMP已转入受体材料。