论文部分内容阅读
背景与目的缺血性脑卒中是一种危害性极高的中枢神经系统相关疾病。临床上在缺血性脑卒中的药物治疗方面仍存在不足和缺口,因此急需探索药物作用的新靶点与新型治疗药。丁苯酞（3-n-butylphthalide,NBP）是目前临床上用于治疗缺血性脑卒中的药物,但存在不良反应且生物利用度较低。（±）-5-溴-2-（5-氟-1-羟基戊基）苯甲酸钙[（±）-5-bromo-2-（5-fluoro-1-hydroxyamyl）calcium benzoate,MTB-1806]是在NBP的结构基础上,经过优化后的一种新型化合物。本实验室前期研究发现MTB-1806对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤（middle cerebral artery occlusion,MCAO）具有保护作用,可以显著改善大鼠神经功能缺失,减小大鼠脑梗死和脑肿胀体积,其机制可能与抑制p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK）的表达,增强细胞自噬相关,但是具体靶点尚未明确,为寻求MTB-1806的具体作用靶点,本研究采用H2O2诱导PC 12细胞建立氧化应激损伤模型,通过体外实验探究MTB-1806对细胞保护作用及作用靶点。方法:1 建立PC12细胞氧化应激损伤模型,确定MTB-1806的分组浓度PC12细胞采用不同的H2O2浓度和时间处理,以存活率和细胞形态变化作为评价指标,筛选稳定的PC12细胞氧化应激损伤模型诱导条件。绘制MTB-1806 对 H2O2 诱导的 PC12 细胞损伤的保护作用的量效关系 曲线,确定其最小有效浓度、半数有效浓度（EC50）和最大有效浓度。2 分组与给药实验一:PC12 细胞分为 6 组:Control 组;H2O2组;NBP（15μmol/L）组;MTB-1806 1、15、30 μmol/L组。NBP组和MTB-1806各组均需加入对应浓度的NBP或MTB-1806预处理3小时后,再进行H2O2损伤处理。实验二:PC12细胞平均分为6组:Control组;H2O2组;NBP（30 μmol/L）组;MTB-1806（30μmol/L）组、Nrf2抑制剂ML385（5μmol/L）组、ML385+MTB-1806组。ML385组和ML385+MTB-1806组均需在NBP或MTB-1806孵育前用ML385孵育0.5 h,再进行NBP或MTB-1806孵育3 h,最后进行氧化应激处理。3 观察指标倒置显微镜观察MTB-1806对H2O2诱导的PC12细胞氧化应激损伤的形态学改变;采用CCK8法检测各组细胞存活率;荧光探针DCFH-DA染色法检测细胞内活性氧（ROS）水平;生化试剂盒检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、丙二醛（malonic dialdehyde,MDA）和谷胱甘肽（glutathione,GSH）的含量;Annexin V-FITC/PI染色法观察细胞凋亡率;蛋白质印迹法（Western Blot）验证细胞凋亡相关蛋白表达的变化;罗丹明123（Rh123）染色法检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）的变化;透射电子显微镜观察各组细胞线粒体形态变化。观察指标实时荧光定量法（RT-qPCR）检测各组细胞中Nrf2通路相关基因p62、Keap1、Nrf2、HO-1、CAT和SOD,自噬相关基因Atg4、Atg5和Rab5的相对表达量。Western Blot法检测各组细胞中p62、Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表达水平,自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达水平;免疫荧光染色观察各组细胞中Nrf2核内转移变化;观察抑制Nrf2通路后MTB-1806的保护作用是否被减弱。结果:1 氧化应激损伤模型的建立根据CCK8实验结果,最终选用浓度为400 μmol/L的H2O2-低糖DMEM培养基作用24 h以建立稳定的PC12细胞氧化应激损伤模型。2 MTB-1806对H2O2诱导的PC12细胞氧化应激损伤的保护作用结果显示,H2O2组较Control组显著降低细胞的存活率（P＜0.01）;相比H2O2组,1-50 μmol/L的MTB-1806组的细胞存活率呈浓度依赖性升高（P＜0.05,P＜0.01）。通过量效曲线确定MTB-1806的最小有效浓度为1μmol/L,EC50 为 15μmol/L,最大有效浓度为 30 μmol/L。3 MTB-1806抑制PC12细胞氧化应激后的ROS聚集结果显示,相比Control组,H2O2组ROS显著升高（P＜0.01）;相比H2O2组,MTB-1806各组浓度依赖性地降低ROS聚集（P＜0.01）。4 MTB-1806抑制PC12细胞氧化应激后的细胞损伤和脂质过氧化结果显示,相比Control组,H2O2组细胞LDH漏出量和MDA含量显著增加,GSH含量显著降低（P＜0.01）;相比H2O2组,MTB-1806各组均不同程度地降低LDH漏出量和MDA含量,同时升高GSH含量（P＜0.01,P＜0.05）。5 MTB-1806抑制PC12细胞氧化应激后的细胞凋亡流式细胞与Western Blot实验结果显示,相比Control组,H2O2组细胞凋亡率、Bax/Bcl-2的比值和cleaved caspase-3/caspase-3的比值较显著性增加（P＜0.01）;MTB-1806各组的细胞凋亡率与比值较H2O2组显著降低（P＜0.05,P＜0.01）。6 MTB-1806改善氧化应激PC12细胞的MMP与线粒体状态。结果显示,与Control相比,H2O2组MMP明显降低（P＜0.01）并且细胞线粒体变性受损且肿胀;MTB-180各组MMP较H2O2组呈浓度依赖性升高（P＜0.05,P＜0.01）并能够显著逆转线粒体受损形态。。7 MTB-1806激活氧化应激PC12细胞的Nrf2通路RT-qPCR和Western Blot实验结果显示,MTB-1806各组上调氧化应激PC12细胞的p62、Nrf2、HO-1、CAT和SOD的表达量以及Nrf2的蛋白表达量,下调Keapl表达量（P＜0.05,P＜0.01）;ML385组下调Nrf2、HO-1、CAT和SOD表达量（P＜0.05）;与MTB-1806组相比-,ML385+MTB-1806组细胞Nrf2、HO-1和SOD表达量以及Nrf2的蛋白表达量呈不同程度下降（P＜0.05,P＜0.01）。8 MTB-1806促进氧化应激PC12细胞的Nrf2的核内转免疫荧光结果显示,相比Control组,H2O2组荧光强度稍增强;相比H2O2组,MTB-1806各组Nrf2表达量显著增多且呈剂量依赖性;与MTB-1806组相比,ML385+MTB-1806组细胞Nrf2总量和核Nrf2表达量降低。9 抑制Nrf2通路后减弱MTB-1806对氧化应激PC12细胞的保护作用结果显示,与MTB-1806组相比,ML385+MTB-1806组增加细胞凋亡率和ROS的荧光峰值,降低细胞MMP（P＜0.05,P＜0.01）。10 MTB-1806促进氧化应激PC 12细胞的自噬相关基因与蛋白的表达量RT-qPCR结果显示,相比Control组,H2O2组的Ag4、Atg5和Rab5的基因表达量升高（P＜0.05,P＜0.01）;相比H2O2组,MTB-1806各组的表达量进一步增多（P＜0.05,P＜0.01）。Western Blot结果显示,相比Control组,H2O2组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值和Beclin-1的表达量显著升高（P＜0.01）;相比H2O2组,MTB-1806各组的值进一步增多（P＜0.05,P＜0.01）。MTB-1806（15 μmol/L）组的作用优于NBP组（P＞0.05）。结论:MTB-1806对H2O2诱导的PC12细胞氧化应激损伤具有保护作用;其机制与抗氧化、抑制凋亡和激活p62-keap1-Nrf2通路并促进自噬有关。