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本文以一株能在胞外大量积累丙酮酸和α-酮戊二酸(α-KG)的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)四重维生素的营养缺陷型菌株WSH-IP303为研究菌株,采用外源添加维生素和乙酸、过量表达acetyl-CoA合成酶和过量表达丙酮酸脱羧酶等三种策略,调节细胞内Acetyl-CoA/CoA比率,使碳代谢流从过量积累丙酮酸转向过量积累α-酮戊二酸。主要研究结果如下:1.随着培养基中唯一碳源乙酸钠浓度的升高,菌体浓度不断升高。当培养基中乙酸钠浓度为6 g/L时,细胞浓度和α-KG浓度(13.5 mmol/L)均达到最大值。此时,胞内acetyl-CoA的浓度为36.63±2.08 nmol/g DCW,Acetyl-CoA/CoA的比率为0.13;继续添加乙酸钠(≥6 g/L)并不能有效提高细胞浓度、acetyl-CoA含量和α-KG的产量;在葡萄糖乙酸混合发酵培养基中添加乙酸钠浓度为6 g/L时,α-KG的产量达到最高值13.35 g/L,胞内Acetyl-CoA为6.09±0.61μmol/ g DCW,Acetyl-CoA/CoA比值达到0.47,此时Cα-KG/CPYR为0.46;通过外源增加VB1和乙酸钠浓度均可以加强acetyl-CoA的合成,胞内acetyl-CoA水平随着培养基中VB1和乙酸钠浓度的增加而增加,同时促进了α-KG的合成。当VB1的浓度为0.015 mg/L时,α-KG的产量最高达13.02 g/L,胞内Acetyl-CoA为6.42μmol /g DCW,Acetyl-CoA/CoA比值达到0.92,Cα-KG/CPYR的值为0.50。2.为了研究acetyl-CoA及其衍生物在细胞内的形式和含量对代谢途径及代谢流量的影响。将来源于酿酒酵母中编码acetyl-CoA合成酶ACS2基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的工业菌株Torulopsis glabrata中,获得了一株acetyl-CoA合成酶活性提高了9.2倍(1.20 U/mg protein)的重组菌T. glabrata ACS2-1。与出发菌株WSH-IP303相比,重组菌T. glabrata ACS2-1:(1)能以乙酸为唯一碳源在胞内积累0.94μmol/g DCW的acetyl-CoA;(2)以葡萄糖为唯一碳源时胞内acetyl-CoA浓度、α-KG产量和Cα-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的3.22、2.05和2.52倍;(3)在葡萄糖培养基中添加4 g/L乙酸,导致acetyl-CoA浓度、α-KG产量和Cα-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的4.55、2.47和3.75倍,α-KG浓度达到17.8 g/L。3.将来源于酿酒酵母中编码丙酮酸脱羧酶PDC1基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的工业菌株Torulopsis glabrata中,获得了一株丙酮酸脱羧酶活性提高了14.2倍(7.22±0.09 U/mg protein-1)的重组菌T. glabrata PDC1-1。在葡萄糖培养基中添加30 g/L丙酮酸时,重组菌T. glabrata PDC1-1与对照菌株T. glabrata::pYES2相比:(1)丙酮酸脱羧酶活性提高了14.16倍(7.22±0.09 U?mg of protein-1);(2)重组菌株T. glabrata PDC1-1α-KG产量和Cα-KG/Cpyr分别为:38.8 g/L和1.39,分别是对照菌的182%和284% ; (3)重组菌T. glabrata PDC1-1胞内acetyl-CoA节点代谢通量和acetyl-CoA/CoA比对照菌分别提高了2.38倍和3.76倍,达到17.55μmol/g DCW和2.37,而CoA浓度则降低了11.1%;(4) T. glabrata CCTCC M202019是乙酸渗漏缺陷型菌株,其丙酮酸脱羧酶活性组成型降低。在普通发酵培养基中重组菌T. glabrata PDC1-1的PDC1活力是T. glabrata CCTCC M202019菌株的15.63倍,其中α-KG的产量和Cα-KG/Cpyr比值分别是其的4.55倍(31.2 g/L)和7倍(1.68)。