流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),是一种含有8个基因片段的分节段RNA病毒。病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型,其中A型对人类危害最严重,A型引起的并发症危害大,易造成神经-内分泌-免疫网络的紊乱。A型流感病毒的基因组是负链RNA,因而直接不具有感染性,各个RNA片段需要与聚合酶蛋白(PB2、PBI、PA,统称为P蛋白)及核蛋白(NP)结合在一起形成核糖核蛋白复合物即RNPs才有活性。流感病毒感染时,病毒首先与宿主细胞表面的特异性HA受体唾液酸(SA,N-乙酞神经氨酸)残基结合,通过融膜进入细胞后释放出RNPS,RNPS进入细胞核才开始病毒基因组的复制和转录,每个RNA片段单独组成一个转录单位,转录出mRNA和互补RNA(cRNA),mRNA翻译合成病毒蛋白,cRNA复制生成子代RNA病毒,然后在细胞浆中组装成完整的病毒粒子。流感病毒的反向遗传操作技术建立的难度较大,原因在于要同时在细胞内形成8个功能性核糖核蛋白复合物(RNPs)。流感病毒拯救技术的发展滞后于其它负义RNA病毒,流感病毒与大多数其它负义RNA病毒不同在于流感病毒基因组是在细胞核内复制。经过近10年的发展,在1999年Neumann等和Fodor等分别报道了改造后完全以质粒为基础的反向遗传技术,这是流感病毒拯救技术发展史上的转折点。其优点是不再像早期的方法那样感染细胞不再需要为RNA合成提供辅助病毒,从而避免了大量的筛选工作。本研究采用RG技术,通过8质粒流感病毒拯救系统,将冷适应、减毒病毒株A/AA/6/60(H2N2)的6个内部基因全片段克隆入pAD3000,其中的PB2、PB1、NP基因人工引入共5个氨基酸的突变。同时把2006～2007年流行株A/Wisconsin/67/2005(H3N2)的2个表面基因片段克隆入pAD3000,从而构建了8个转录/表达载体,用于拯救重配H3N2亚型人流感病毒减毒株,为流感减毒活疫苗的制备提供了保证。研究采用由美国St.Jude儿童研究医院的Robert Webster博士提供的上述PR8 8质粒系统,一一替换成构建好的用于重配病毒拯救的8个转录/表达质粒,共有8种7+1组合,验证其中每一个基因片段是否能够正常工作;同时用PR8的HA和NA表面基因以及H1N1的表面基因与验证好的冷适应株的6个内部骨架组合(6+2组合,重配病毒分别简写为rgAA-PR8和rgAA-H1N1),共转染细胞,验证冷适应株A/AA/6/60的6个内部基因是否能够协同发挥作用,同时对重配病毒的生物学特性进行了鉴定;在此基础上,接着把2006～2007年流行株A/Wisconsin/67/2005(H3N2)的表面基因与A/AA/6/60的6个骨架基因进行重排组合,对产生的重配病毒(6+2组合,简写为rgAA-H3N2)进行了初步鉴定,深入的研究还在进行之中。这些研究内容为我们弄清楚流感病毒基因组及其蛋白质在病毒复制及致病机制中的作用建立了平台,也为冷适应流感减毒活疫苗的研制以及粘膜免疫保护机制的研究提供了理论依据。本部分实验针对弱毒疫苗的特点,建立了rgAA-H3N2病毒株的三级毒种库并进行系统、全面鉴定,同时免疫BALB/c小鼠利用HI和ELISA等方法对其免疫原性进行了初步研究,为H3N2亚型流感减毒活疫苗的研发奠定了理论基础。这些研究为研制高效、安全的冷适应流感减毒活疫苗以及阐明流感病毒呼吸道粘膜免疫保护机制奠定了基础,为其它病毒减毒活疫苗研制奠定了基础。