昆虫微孢子虫作为一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物，具有原核生物的许多特征，在物种进化研究上是一个不可忽略的物种。在自然界中被称为嗜昆虫的微孢子虫，它对调节和控制昆虫的种群数量起到非常重要的作用，是昆虫病理学的重要研究内容之一。在利用微孢子虫进行“以虫治虫”的研究方面，蝗虫、蟑螂、蚊子等许多农林、卫生害虫的微孢子虫被广为研究；在农业生产中，由于微孢子虫对经济昆虫蚕、蜂以及产业化昆虫等的寄生而带来了毁灭性的危害，长期以来一直受到人们的广泛关注。因此系统地开展对昆虫微孢子虫鉴别技术的研究，对提高家蚕等经济昆虫微粒子病的诊断水平，开发实用性诊断试剂盒的研制，对预防和控制家蚕等经济昆虫微粒子病的流行发生有实际的指导意义；通过对不同来源的昆虫微孢子虫16SrDNA基因的系统发育分析研究，对开发利用昆虫微孢子虫资源、促进微孢子虫分类学研究的发展和系统地控制家蚕等经济昆虫微粒子病的发生提供科学依据。 本文在广泛收集国内各种家蚕病原微孢子虫和昆虫来源微孢子虫材料的基础上，应用最新的微孢子虫鉴别技术和手段，分别从微孢子虫孢子的形态识别、核酸染色示踪和PCR分子诊断等方面，系统地研究了对微孢子虫的各种最新鉴别技术，包括：利用ZEISSAxioplan多功能显微镜和图像识别软件系统，并应用CalcofluorWhiteM2R染色方法和DAPI核酸染色示踪技术等，对微孢子虫孢子的形态、大小以及家蚕微孢子虫侵染昆虫细胞的经过等进行了观察比较。根据微孢子虫16SrRNA基因序列的保守区段，优选多套PCR引物、筛选适合诊断家蚕微孢子虫和感染家蚕的近缘微孢子虫的PCR引物和诊断方法；从模拟蚕业生产和生产检毒实践基础上，选用一对有效的引物，开发有一定实用性的微孢子虫核酸诊断试剂盒；并通过采用引物重迭交替的PCR方法，对8种主要的家蚕病原微孢子虫、4种昆虫来源的微孢子虫、13株国内各个主要蚕区来源微孢子虫的16SrRNA基因进行了PCR扩增和测序，应用多种分子生物学软件，对上述来源的各种微孢子虫序列进行比对、拼接、碱基组成分析比较，进而建立它们16SrDNA的分子系统发育树，以此分析各种微孢子虫之间的系统发育关系。主要获得的研究结果如下： 1.利用ZEISSAxioplan多功能显微镜及其配套软件，可以有效地区分微孢子虫孢子和各种病原细菌、病毒、真菌孢子以及组织碎片。通过结合该显微镜的相差功能和图像识别软件，比其他传统镜检方法更快速有效地识别各种昆虫微孢子虫，较精确地测定孢子大小。结果显示本实验所观察的各种昆虫微孢子虫的形态比较相似，以卵圆形或长椭圆形为多，长约3～3.8μm，，宽约1.3～3μm，发现各种不同昆虫来源的微孢子虫在家蚕体内继代繁殖多次之后，孢子的形态大小有变大的趋向。 2.在国内首次报道应用CalcofluorWhiteM2R荧光染色剂快速染色鉴别微孢子虫孢子。通过该染色剂染色可以在短时间内将各种昆虫微孢子虫孢子快速特异地染上强烈的青蓝色或绿蓝色的荧光，借助荧光显微镜可以有效地区分病毒多角体、细菌和真菌孢子等。 3.成功地应用了DAPI核酸染色示踪技术观察比较家蚕微孢子虫NosemabombycisNaegeli，1857侵染昆虫细胞的经过，该技术将为国内相关研究提供新方法。结果表明家蚕微孢子虫N.bombycis孢子侵入家蚕BmN细胞的时间较侵入昆虫Sf21细胞(Spodopterafrugiperda)的滞后，且N.bombycis感染Sf21细胞比对家蚕BmN细胞更加敏感。 4.成功建立了基于CTAB试剂有效抽提各种微孢子虫模板DNA的方法；初步建立的煮沸法抽提微孢子虫模板DNA技术为国内同行提供了新思路。发现引物V1F/530R可以有效地用于家蚕N.bombycis孢子的PCR鉴别，敏感度为1μL102～3个孢子/毫升的模板DNA，超过了光学显微镜的检测水平。 5.在模拟感染家蚕微粒子病和蚕业生产检毒实践的PCR分子诊断技术研究基础上，本研究建立了一套行之有效的可以对各种微孢子虫病样品、带毒蚕种和蚕蛾样品等进行有效鉴别的PCR分子诊断技术，并在此基础上研制了一套快速识别和诊断昆虫微孢子虫的PCR核酸诊断试剂盒，对各种经济昆虫微孢子虫病的确诊和预知检查有一定的实用性。 6.通过对12种不同来源的家蚕和昆虫微孢子虫16SrDNA基因的PCR测序、生物信息学软件的拼接和分析，获得了龙眼裳卷蛾微孢子虫(Cs)等8种微孢子虫97％以上的16SrDNA全基因序列和广东斜纹夜蛾微孢子虫(PLG)等4种昆虫微孢子虫的89％以上的16SrDNA基因序列，并构建了它们的分子系统发育树，由此获得了其中一些有关家蚕微粒子病病原来源于野外昆虫微孢子虫感染的分子证据。 7.研究认为国内蚕业生产上主要致病的病原微孢子虫可分为两个类群：典型的N.bombycis类群和Nosema/Vairimorpha混合类群。其中广东MG4、MG5、湖南的Mh7521、Mh8535落在典型的N.bombycis的进化枝上，而广东的MG2与昆虫来源的Cs、Pr微孢子虫则同处在Nosema/Vairimorpha混合类群的进化枝上，它们的进化关系紧密。发现不同来源的另一菜粉蝶微孢子虫CFD和斜纹夜蛾微孢子虫PLG、PLH以及小菜蛾微孢子虫Px等一起落在Nosema的进化枝上。这些数据证明作为危害桑树等植物的各种害虫是Nosema类群微孢子虫的重要宿主种群，是家蚕微粒子病的巨大感染源。 8.采用引物Vlf/530r，对国内8个主要蚕桑生产区来源的微孢子虫16SrDNA基因进行了PCR扩增测序及系统发育分析，结果表明大部分生产来源的家蚕病原微孢子虫与典型的N.bombycis类群关系最近，同时还初步证实生产上发现的浙江小孢子属于内网虫属Endoreticulatus微孢子虫。 9.通过对国内外在GenBank上报道的与家蚕相关的主要昆虫病原微孢子虫的16SrDNA全基因序列进行了系统发育分析，发现相同或不同类群的昆虫微孢子虫，在分布上表现出地理隔离的现象，日本的N.bombycis与中国、印度的有差异，相同地区不同来源的微孢子虫表现出基因多样性，暗示这些昆虫微孢子虫种间存在物种分化现象。 基于以上的研究结果，本文系统地引进和建立了对家蚕等昆虫微孢子虫的最新鉴别技术，建立的对家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术和PCR核酸诊断试剂盒有一定的实用性和生产实践价值。关于不同来源微孢子虫分子系统发育关系的分析结果，可以为昆虫微孢子虫的分类和溯源提供理论参考，为开发利用各种昆虫微孢子虫进行生物防治提供了科学依据。