甲醛是最简单、最重要的活性羰基化合物（RCS）,参与多种基本的生命活动过程,包括基因表达调控和长期记忆的存储、再现等。但是过量的甲醛能够使蛋白质和DNA发生交联,从而损害其结构和功能,诱发甲醛应激。甲醛的浓度异常与癌症、糖尿病和神经退行性疾病等的发生发展密切相关。然而,甲醛的这些生理、病理学的分子机制仍然尚未阐明,尤其是甲醛在免疫系统和免疫反应中的浓度变化和相关作用,尚无明确报道。同时,O₂^·-是最重要的一类活性氧（ROS）,可通过酶促或非酶促反应转化为过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（^·OH）、次氯酸（HClO）、过氧亚硝酸根（ONOO^-）等其他ROS,是氧化应激的重要标志物。O₂^·-水平异常升高会导致细胞氧化损伤,诱导细胞坏死或凋亡,进而诱发多种疾病,如中风、神经退行性疾病、癌症等。因此,监测甲醛和O₂^·-等活性小分子或离子的产生、分布、代谢、消除等浓度变化,对于阐明所涉及的生理病理学分子机制,对于相关疾病诊断、治疗和药物研发,均具有十分重要的意义。由于具有易操作性、非侵入性、高时空分辨和实时监测等优势,基于探针的荧光成像技术成为研究活性分子浓度变化及相关分子事件的理想工具。本论文针对现有探针存在的缺陷或不足之处,设计合成具有新颖结构和优良性能的分子荧光探针,并采用探针监控细胞和动物模型中甲醛和O₂^·-的浓度波动和生物学功能,揭示甲醛和O₂^·-在相关生理病理过程中的调控机制和调控网络。本论文主要开展了以下两方面的研究工作:1.基于氨基胍的快速响应型荧光探针用于成像宿主免疫反应中产生的甲醛。我们以氨基胍作为甲醛的新型识别基团,以四苯乙烯作为荧光基团,构建了检测甲醛的新型荧光探针TPE-AG。TPE-AG能够快速响应甲醛,且对甲醛具有高灵敏度和高选择性。采用TPE-AG研究发现,在脂多糖（LPS）诱导的免疫反应中,巨噬细胞和小鼠感染组织内甲醛的浓度显著升高,可能与抵抗病原体入侵的免疫防御功能相关。在此过程中,甲醛主要由LSD1酶催化产生,且同时受到ROS和一氧化氮的调控,而LSD1也能一定程度上调控NADPH氧化酶和一氧化氮合酶,进而影响ROS和一氧化氮的生成。上述结果表明,在宿主免疫反应中,ROS、RNS和RCS之间存在复杂的分子调控网络。2.超氧阴离子双光子比率型荧光探针的设计合成及生物学应用。我们以三氟甲磺酸酯作为O₂^·-的特异性响应基团,以四苯乙烯-苯并噻唑作为荧光基团,设计合成了响应O₂^·-的比率型双光子荧光探针TPE-BT-TF。通过实验探究发现,该探针能够高选择、高灵敏检测O₂^·-。探针自身荧光发射在480 nm处,与O₂^·-反应后,发射波长红移至580 nm,实现了比率响应O₂^·-。采用TPE-BT-TF,借助双光子共聚焦显微镜,我们成功实现了对鱼藤酮刺激产生的细胞内源性O₂^·-进行比率荧光成像。探针TPE-BT-TF的生物学应用正在进一步研究之中。综上所述,本论文针对甲醛和O₂^·-两种生物活性物质,分别设计合成了两种分子荧光探针TPE-AG和TPE-BT-TF。两种探针均具有优良的光学性质和良好的响应性能,能够分别对生物样品中的甲醛或O₂^·-进行双光子荧光成像,为相关病理生理学及分子机制研究提供了高效的原位成像工具。