背景生物反应器是一个由具有内在网络通道的聚合物构成的立体框架结构,同时辅以流动的培养液提供营养。通道内外相隔一层半透膜,这样便为大量有效地培养细胞并使之发挥功能提供了条件。生物反应器在生物型人工肝脏的应用已有30多年的历史。自从1972年Knazek设计了中空纤维生物反应器,1975年Wolf等人将其应用于肝细胞的培养后,生物反应器在人工肝上的应用不断进展。除此之外,中空纤维生物反应器也被应用于人工肾小管辅助装置的构建,研究者在采用该装置治疗急性肾功能衰竭和脓毒症的过程中,发现肾小管上皮细胞可通过调节机体炎症反应水平影响脓毒症的预后。脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征,具有发病率和死亡率高、治疗效果差等特点。在脓毒症的发生发展过程中,内皮细胞无论是形态还是功能上均受到严重的损害,而内皮细胞的损害又进一步加重了脓毒症时的炎症和凝血。那么,采用细胞疗法体外替代内皮细胞的功能是否能改善脓毒症的预后呢?基于此设想,本课题通过在中空纤维生物反应器的外腔种植内皮细胞,构建内皮细胞生物反应器,并对内皮细胞的形态和生物活性进行鉴定,以期为脓毒症的治疗提供一项新的手段。方法本实验分为三部分:1、局部试验,探讨内皮细胞能否在聚砜膜中空纤维的外表面生长。首先将聚砜膜中空纤维缠绕于盖玻片上制成聚砜膜片,环氧乙烷灭菌处理,生理盐水清洗,然后将其置于培养皿中。加入培养液和内皮细胞,观察内皮细胞在聚砜膜中空纤维外表面的生长情况。2、无纺布内皮细胞生物反应器的构建。先用生理盐水对反应器的内腔和外腔进行预冲,再将内皮细胞悬液植入其外腔,封闭外腔口;内腔与培养液循环式人工毛细管培养系统相连接,采用含10%胎牛血清和“双抗”的RPMI1640培养液进行培养。管路连接后将整个装置置于5%CO₂、37℃培养箱中孵育。定时取反应器内腔培养液,用于乳酸、葡萄糖、一氧化氮、蛋白C和vWF的检测。内皮细胞在生物反应器外腔生长5d后,剖开反应器外壳,取出其中的无纺布,行光镜、荧光显微镜和电镜检查,观察内皮细胞在无纺布上的生长情况。3、微载体内皮细胞生物反应器的构建。首先对微载体进行水化膨胀、高压灭菌处理,然后与内皮细胞共同置于75cm²的培养瓶中,加入含10%胎牛血清和“双抗”的DMEM高糖培养液,间断振荡培养。待内皮细胞长满微载体表面后,行光镜、荧光显微镜和电镜检查,观察内皮细胞在微载体上的生长情况。然后将长满内皮细胞的微载体移入生物反应器的外腔,封闭外腔口,内腔与培养液循环式人工毛细管培养系统相连接（同无纺布内皮细胞生物反应器的构建）,采用无血清、含“双抗”的DEME高糖培养液进行培养。定时取反应器内腔培养液,用于乳酸和葡萄糖的检测。结果1、局部试验:光镜、荧光显微镜下,聚砜膜中空纤维侧面光滑,未见内皮细胞贴附、生长。在同一培养皿中,内皮细胞生长状态良好。2、无纺布内皮细胞生物反应器的构建:荧光显微镜下,无纺布由长短不一的丝状物不规则交织而成,丝状物表面可见大量内皮细胞贴附,密度均匀,细胞核有的呈椭圆形,有的呈细长形,部分细胞可见双核,增值明显,罕见浓缩、碎裂的细胞核。电镜下,内皮细胞贴附于无纺布纤维丝的表面,大部分细胞伸出触角,具有良好的内皮细胞的形态。培养液中乳酸的浓度随时间变化进行性升高,升高的速度逐渐加快,换液时浓度下降;葡萄糖的浓度则进行性降低,降低的速度逐渐加快,换液时,浓度上升;NO浓度在最初数小时内有所降低,之后进行性升高。内皮细胞在反应器内生长5d后取出反应器外腔的培养液,离心后,内皮细胞数量很少。将内皮细胞种植于培养瓶中,2d后观察内皮细胞生长状态良好,无污染。反应器构建120h（即构建结束）时取反应器外腔培养液进行vWF、蛋白C的检测,发现前者可检测得出,但后者低于检测范围。3、微载体内皮细胞生物反应器的构建光镜下,内皮细胞长满微载体表面,微载体表面凹凸不平。荧光纤维镜下,内皮细胞核贴附于微载体表面,分布均匀,罕见浓缩、碎裂的细胞核。电镜下,内皮细胞贴附于微载体表面,伸出触角,具有良好的内皮细胞的形态。培养液中乳酸的含量随时间变化进行性升高,葡萄糖的浓度进行性降低。结论内皮细胞不能在聚砜膜中空纤维的外表面黏附、铺展、生长,但聚砜膜对内皮细胞的生长不产生抑制作用。无纺布和微载体是良好的内皮细胞生长的生物界面,采用无纺布或微载体联合聚砜膜中空纤维所形成的生物反应器能构建具有生物活性的内皮细胞生物反应器。