雌激素在乳腺癌的发生发展中扮演着重要的作用。传统观点认为,介导雌激素效应的主要媒介是位于细胞核的核雌激素受体(nuclear estrogen receptors,n ERs)ERα与ERβ,它们可作为转录因子与顺式作用的雌激素反应元件(estrogen response element,ERE)相结合调节下游靶基因的表达。G蛋白偶联雌激素受体(G-protein coupled estrogen receptor,GPER),也称G蛋白受体30(G-protein receptor,GPR30),是近年来被鉴定出的第三种独立作用的新型雌激素受体,可同时被雌激素及雌激素受体拮抗剂他莫昔芬(tamoxifen,TAM)活化,参与乳腺癌细胞生长、侵袭、血管生成、药物耐受等恶性生物学行为。肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)是乳腺癌微环境的主要成分,它通过分泌多种细胞因子调节肿瘤生长,同时分泌基质金属蛋白酶等参与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)重构,利于肿瘤细胞侵袭和转移等。因此,肿瘤细胞与CAFs之间的“cross-talk”被认为是促进肿瘤进展的关键步骤之一。前期研究提示:CAFs体外单独培养条件下,GPER主要表达于细胞核中,雌激素可活化GPER/EGFR/ERK通路调控下游靶基因c-fos与CTGF的表达进而促进CAFs细胞增殖与迁移;TAM亦可活化GPER上调CAFs中芳香化酶(CYP19A1)的基因表达,促进局部雌激素的合成,可能在参与TAM耐受中具有重要作用。然而,现有研究主要集中于CAFs细胞本身的GPER生物学功能:如促进CAFs细胞增殖、迁移等,对乳腺癌细胞与CAFs之间的“cross-talk”是否影响CAFs中GPER的细胞内定位及其下游生物学效应仍然不清楚。本研究拟进一步探讨乳腺癌细胞诱导微环境CAFs中GPER发生核浆转位的现象与潜在机制,及其核浆转位对肿瘤能量代谢与多药耐受中的可能作用。主要分为以下五个部分:1.乳腺癌细胞对微环境CAFs中GPER核浆定位的影响及其核浆分布与临床病理变量的相关性目的:探讨不同亚型的乳腺癌细胞对微环境CAFs中GPER核浆定位的影响及其核浆分布与临床病理变量的相关性。方法:应用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)染色检测21例正常乳腺组织、231例原发性乳腺癌及53对TAM耐药前后的乳腺癌组织标本中间质成纤维细胞(tumor stromal fibroblasts,TSFs)内GPER的表达与定位情况,并与肿瘤临床病理变量进行相关性分析。采用细胞免疫荧光(immunofluorescence,IF)方法检测直接与间接共培养前后CAFs中GPER细胞内定位的变化。利用蛋白免疫印迹(western blotting,WB)检测不同亚型的肿瘤细胞条件培养基(conditioned medium,CM)处理前后CAFs中GPER的核浆表达量。结果:(1).45%(104/231)的原发性乳腺癌组织中TSFs呈现GPER阳性表达,其中80例(76.9%)表现为单纯性细胞浆表达,24例(23.1%)表现为核浆联合表达类型。临床病理变量统计分析提示TSFs中GPER单纯性细胞浆表达与不良临床分期(P=0.001)及较差肿瘤分子亚型(P<0.001)显著相关。此外,GPER在TSFs细胞浆中的表达量随肿瘤恶性程度增加及肿瘤获得TAM耐受而显著升高(P<0.05)。(2).体外单独培养条件下,GPER主要表达于乳腺癌细胞的细胞浆中,而在CAFs中则主要表达于细胞核。将CAFs与不同亚型的乳腺癌细胞直接共培养24h后均可观察到CAFs中GPER的表达定位由细胞核转位入细胞浆中,而肿瘤细胞中则未观察到明显的GPER转位现象。进一步用肿瘤细胞条件培养基分别处理CAFs 12h、24h、36h、48h后亦可检测到GPER在细胞核中的蛋白表达逐渐降低,而在细胞浆中的表达量显著升高。更加有趣的是,高恶性程度及获得药物耐受(TAM及阿霉素耐药)的乳腺癌细胞亚型其诱导CAFs中GPER发生细胞浆转位的能力更强。结论:GPER主要表达于TSFs的细胞浆中。与核浆联合表达类型相比,其在TSFs中的单纯性细胞浆表达可能预示着更差的临床预后及TAM药物耐受;乳腺癌细胞与CAFs之间的“cross-talk”可显著诱导CAFs中GPER转位入细胞浆,且以上转位现象更易发生于高恶性程度及耐药乳腺癌细胞中,提示CAFs中GPER的核浆转位可能在促进肿瘤进展及药物耐受中具有重要作用。2.乳腺癌细胞诱导CAFs中GPER发生细胞浆转位的机制研究目的:探讨乳腺癌细胞诱导CAFs中GPER发生核浆转位的机制。方法:应用免疫共沉淀法(co-immunoprecipitation,Co-IP)检测乳腺癌细胞条件培养基处理前后CAFs中GPER与核输出蛋白CRM1的相互结合情况。生物信息学方法预测GPER氨基酸序列中的潜在核输出信号(nuclear export signals,NES)序列,并对该序列进行突变,采用细胞免疫荧光法检测NES序列突变前后,肿瘤细胞条件培养基对CAFs中GPER细胞内定位的影响。利用蛋白免疫印迹法检测肿瘤细胞条件培养基活化CAFs中MAPKs及PI3K下游各信号通路情况,并进一步应用CRM1特异性抑制剂来普霉素B(leptomycin B,LMB)及以上各信号通路的小分子特异性抑制剂干扰CRM1运输功能与上游调控信号后,细胞免疫荧光及蛋白免疫印迹法分别检测CAFs中GPER的核浆分布与表达量。结果:(1).不同亚型的乳腺癌细胞条件培养基处理CAFs后均可显著观察到GPER与核输出蛋白CRM1的相互结合;查阅文献报道及生物信息学方法可预测到GPER氨基酸序列中的NES序列(YFINLAVADLILV),对其进行突变后(YFINLAVADAAAV),可明显阻断乳腺癌细胞诱导CAFs中GPER的细胞浆转位现象,应用CRM1特异性抑制剂LMB(5ng/ml)干扰CRM1输出功能亦得到以上类似结果。(2).肿瘤细胞条件培养处理CAFs后,在不同时间点(5min、15min、30min、60min、120min)可检测到MAPK/ERK、MAPK/P38、MAPK/JNK及PI3K/AKT信号通路被显著活化,分别应用以上信号通路特异性抑制剂U0126(10μM)、SB203580(SB,10μM)、SP600125(SP,10μM)、Wortmannin(WM,10μM)特异性阻断CRM1的上游潜在调控信号后发现,仅PI3K/AKT抑制剂WM可显著抑制CAFs中GPER的核浆转位。结论:核输出蛋白CRM1通过识别CAFs中GPER氨基酸序列中的NES序列介导其细胞核转位入细胞浆的出核过程;筛选文献中报道的有关CRM1上游潜在调控信号后明确CAFs中PI3K/AKT信号通路的活化在促进GPER出核过程中具有关键作用。3.不同核浆定位下CAFs中GPER介导的下游信号通路活化情况目的:探讨不同核浆定位下CAFs中GPER介导的下游信号通路活化情况。方法:应用蛋白免疫印迹法检测乳腺癌细胞条件培养基处理前后GPER三种激动剂17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)、G1、TAM活化CAFs中GPER介导的下游EGFR/ERK、EGFR/AKT及c AMP/PKA信号通路的活化情况。采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)检测不同处理条件下CAFs细胞内c AMP的表达变化。利用蛋白免疫印迹及细胞免疫荧光法检测GPER/c AMP/PKA下游c AMP反应元件结合蛋白(c AMP response element binding protein,CREB)的活化及磷酸化CREB(p-CREB)在CAFs细胞核中的表达情况。结果:(1).CAFs单独培养条件下,E2(100n M)、GPER特异性激动剂G1(100n M)、TAM(100n M)可显著活化细胞内EGFR/ERK、EGFR/AKT信号通路,c AMP/PKA信号则未见明显活化。有趣的是,用三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞条件培养基(MDA-MB-468/CM)预处理CAFs 36h条件下,E2、G1、TAM可明显促进细胞中c AMP及下游磷酸化PKA(p-PKA)的表达,并同时活化EGFR/AKT信号通路,而ERK信号则未见明显改变。应用NES序列突变GPER(M)、CRM1特异性抑制剂LMB(5ng/ml)与PI3K/AKT抑制剂WM(10μM)阻断GPER的细胞浆转位后显著抑制E2、G1及TAM诱导的c AMP/PKA信号通路活化,EGFR/ERK信号被重新激活。(2).细胞浆GPER依赖性的c AMP/PKA信号通路活化特异性促进其下游p-CREB在CAFs细胞核上的蛋白表达,GPER(M)、c AMP特异性抑制剂MDL-12330(MDL,20μM)与PKA特异性抑制剂H-89(1μM)可明显阻断以上变化。结论:乳腺癌细胞与CAFs之间的“cross-talk”不仅影响GPER在CAFs中的细胞内定位,更进一步影响GPER活化后所介导的下游信号通路变化,提示不同生理功能条件下,CAFs中可能存在细胞核GPER依赖性的ERK信号与细胞浆GPER依赖性的PKA信号活化等多种作用模式,或在促进肿瘤进展中发挥着不同的功能效应;细胞浆GPER依赖性的c AMP/PKA信号通路显著促进下游转录因子CREB的活化,结合前期研究及文献报道,CAFs中GPER/c AMP/PKA/CREB信号通路的功能尚不明确。因此,深入研究GPER/c AMP/PKA/CREB信号通路及其下游靶基因有助于进一步了解CAFs中GPER的生物学功能。4.细胞浆GPER依赖性的下游c AMP/PKA/CREB信号通路活化对乳腺癌CAFs能量代谢的影响目的:探讨CAFs中细胞浆GPER依赖性的下游c AMP/PKA/CREB信号通路活化及其靶基因改变对CAFs糖代谢的影响。方法:结合文献报道及生物信息学分析芯片数据中转录因子CREB下游的潜在靶基因及其可能涉及的生物学功能情况。实时定量荧光PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测不同处理条件下CAFs中糖代谢关键基因HK2、PFK1、PKM2、G6PD、PDK4、PDK1、LDHA、LDHB、LDHC的表达变化以筛选GPER/c AMP/PKA/CREB下游潜在靶基因。染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)明确转录因子CREB靶向调控下游靶基因表达情况。应用葡萄糖、乳酸、丙酮酸检测试剂盒与Mito-Tracker Green线粒体荧光探针分别检测不同处理条件下CAFs的有氧糖酵解及线粒体活性状况。18F-氟代脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(18F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography/computed tomography,18F-FDG PET/CT)回顾性分析42例临床乳腺癌患者肿瘤组织内间质成纤维细胞(TSFs)中细胞浆GPER的表达与肿瘤(包括原发灶及转移灶)代谢活性及药物反应性的关系。结果:(1).结合文献报道及生物信息学预测分析转录因子CREB下游具有大量与细胞代谢相关的潜在靶基因(>1400个),其中糖代谢关键基因包括HK2、PFK1、PKM2、G6PD、PDK4、PDK1、LDHA、LDHB、LDHC等。q RT-PCR筛选并验证得到以上基因中PDK4与LDHB表达受GPER/c AMP/PKA/CREB信号通路所调控,且呈现细胞浆GPER依赖性,应用GPER特异性拮抗剂G15(1μM)、PKA特异性抑制剂H-89(1μM)、NES序列突变GPER(M)及CREB基因干扰(si CREB)可显著抑制E2、G1与TAM所诱导的PDK4与LDHB基因表达。CHIP实验进一步证实转录因子CREB进入PDK4与LDHB基因启动子区域靶向调控两者的基因表达。(2).CAFs中GPER/PKA信号通路的活化可明显增加细胞的葡萄糖消耗量、乳酸生成量与丙酮酸生成量并同时降低细胞线粒体活性(即发生了有氧糖酵解改变),G15(1μM)与H-89(1μM)显著阻断以上变化。临床18F-FDG PET/CT影像学检查进一步显示TSFs中细胞浆GPER的高表达与高肿瘤代谢活性、较差化疗与TAM药物敏感性具有明显相关性。结论:GPER激动剂E2、G1与TAM通过活化CAFs中细胞浆GPER依赖性的下游c AMP/PKA/CREB信号通路调控靶基因PDK4与LDHB等表达,以改变CAFs的代谢模式:由氧化磷酸化为主导转变为有氧糖酵解为主导,产生更多的乳酸、丙酮酸等高能代谢产物;细胞浆GPER介导的CAFs能量代谢重塑(energy metabolism reprogramming,EMR)可能在改变肿瘤细胞的代谢活性及药物耐受中发挥重要作用。5.CAFs中GPER/PKA信号通路活化介导的“CAFs-乳腺癌细胞”能量代谢耦合对肿瘤多药耐受的作用探讨目的:探讨CAFs中GPER/PKA信号通路活化介导的“CAFs-乳腺癌细胞”能量代谢耦合对肿瘤多药耐受的影响。方法:Mito-Tracker Green线粒体荧光探针分别检测单独培养及与CAFs共培养条件下不同亚型乳腺癌细胞线粒体活性情况。流式细胞术检测“CAFs-乳腺癌细胞”能量代谢耦合(energy metabolic coupling,EMC)前后临床药物TAM、赫赛汀(herceptin)及表柔比星(epirubicin)对肿瘤细胞的杀伤效果,评估EMC对肿瘤细胞的保护作用。结果:(1).CAFs-乳腺癌细胞共培养条件下,E2(100n M)处理CAFs可显著增强不同亚型乳腺癌细胞的线粒体活性,G15(1μM)与H-89(1μM)阻断CAFs细胞中GPER/PKA信号通路明显逆转以上乳腺癌细胞的线粒体活性变化。此外,应用单羧酸转运体抑制剂α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHC,1m M)、乳酸转运体抑制剂quercetin(QUE,10μM)及线粒体活性抑制剂二甲双胍(metformin,Met,100μM)、三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO,10μM)阻断CAFs-乳腺癌细胞之间的EMC亦可显著抑制各肿瘤细胞的线粒体活性。(2).CAFs-乳腺癌细胞共培养条件下,E2刺激CAFs明显减弱TAM、赫赛汀、表柔比星对相应乳腺癌细胞亚型的杀伤效果。有趣的是,应用Met及ATO抑制肿瘤细胞线粒体活性可显著增加乳腺癌细胞凋亡,逆转以上多种药物的耐受情况。结论:雌激素活化CAFs中GPER/PKA信号通路使其发生有氧糖酵解,产生大量的乳酸与丙酮酸等高能产物,通过能量代谢耦合途径供给乳腺癌细胞线粒体“燃烧”,肿瘤细胞通过异常增强的线粒体活性对临床TAM、赫赛汀及表柔比星药物产生抵抗作用。因此,特异性靶向CAFs中GPER/PKA信号通路进而干扰“CAFs-乳腺癌细胞”能量代谢耦合可能是临床中增强乳腺癌患者药物敏感性及逆转多药耐受的有效手段。