VP1蛋白影响鸡传染性法氏囊病毒致病性的分子机制

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鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由鸡传染性法囊病病毒(Infectious bursaldisease virus, IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBD是危害世界养禽业最严重的疾病之一。除经典毒株外,具有致病性的血清I型毒株目前还包括弱毒株、抗原变异毒株和超强毒株(very virulent Infectious bursal disease virus, vvIBDV)。IBDV各型毒株致病性不尽相同,特别是1987年vvIBDV的出现给IBD的防控带来了新的挑战。vvIBDV的高致死率给养禽业造成了严重的损失。探索各型毒株致病性差异的分子基础及分子机制一直是IBDV研究的热点之一。IBDV基因功能及致病机制的早期研究主要聚焦在基因组A节段及其编码的VP2蛋白。近来的流行病学数据显示,基因组B节段及其编码的VP1蛋白与vvIBDV的爆发关系密切。本研究将进一步证实B节段及其编码的VP1蛋白与IBDV致病性增强的关系,定位其具体分子基础,并从病毒自身和宿主因子两个角度探讨其分子机制。克隆获得HuB-1、HeB10XS02、SD10LY013株IBDV流行毒株的全基因组序列。遗传进化分析表明,IBDV VP1蛋白分为明显的3个亚群,即第I亚群(非超强毒)、第II亚群(中国新型vvIBDV)、第III亚群(经典vvIBDV)。HuB-1及SD10LY01VP1属于第III亚群,HeB10XS02的VP1则属于第II亚群。VP1氨基酸序列比对结果表明,I、II、III亚群之间共存在17个保守氨基酸差异位点。根据IBDV毒株的全基因组序列分析和致病性研究,筛选到VP1来源于不同亚群的代表病毒,即Gt(其VP1属于第I亚群)、HLJ0504(其VP1属于第II亚群)、HuB-1(其VP1属于第III亚群)。分别将弱毒Gt、vvIBDV HuB-1的A节段与上述筛选的3个不同亚群代表病毒的B节段进行组合,共拯救6个重组病毒。研究结果表明,VP1蛋白影响IBDV的复制及致病性,第II、III亚群的VP1促进病毒在体内、外的复制,使IBDV的致病性增强,而第I亚群的VP1则降低病毒在体内、外的复制的能力,使IBDV的致病性减弱。根据VP1的三维结构,将VP1划分为3个功能结构域,即N-端结构域、中心活性区(M段)和C-端结构域。以HuB-1毒株VP1的N端、M段、C端替换Gt株的相应区域,拯救获得3个细胞适应重组病毒;同时,以Gt株VP1的N端替换HuB-1株的相应区域,拯救获得1个细胞非适应重组病毒。致病性研究结果表明,VP1N端由强变弱,病毒体外复制能力降低,体内复制能力提高,病毒致病性明显降低。VP1N端(1-167aa)氨基酸序列比对结果表明,VP1N端145-147位氨基酸形成3个独特的三联体基序。不同亚群的B节段具有不同的三联体基序,I亚群为NEG、II亚群为TEG、III亚群为TDN。在此基础上,以弱毒Gt为骨架,将NEG分别替换为TEG或TDN,拯救了2个点突变病毒(rGtTEG,rGtTDN);相应的,以vvIBDV HuB-1为骨架,将TDN分别替换为NDN、TEG或NEG,拯救了3个点突变病毒(rHuBNDN,rHuBTEG,rHuBNEG)。研究结果表明,由NEG替换为TEG或TDN,病毒体外复制能力降低,体内的复制能力增强,致病性增强;反之,则使其体外复制能力增强,体内复制能力降低,病毒致病性降低。聚合酶活性检测结果表明,VP1N端145-147位氨基酸影响VP1聚合酶活性,由NEG替换为TEG或TDN,聚合酶活性明显降低;反之,其聚合酶活性明显提高。VP1聚合酶活性的改变进而引起病毒复制能力的改变,是145-147位氨基酸影响病毒致病性的分子机制之一。为了进一步探索影响VP1聚合酶活性的分子机制,本研究从病毒和宿主两个方面入手探寻影响其活性的因素。研究表明,IBDVVP3蛋白是VP1发挥聚合酶活性的必要因素,但VP3蛋白对病毒聚合酶活性的影响与VP1145-147位氨基酸影响聚合酶活性无正相关性。另一方面,通过酵母共转化实验、CO-IP、激光共聚焦实验证明宿主eIF4AII因子与VP1之间存在相互作用;该蛋白通过与VP1相互作用抑制其聚合酶的活性,进而限制IBDV的复制;进一步聚合酶活性检测表明,宿主eIF4AII因子能够抑制VP1野生型及突变型的聚合酶活性,但eIF4AII抑制聚合酶活性与VP1145-147位氨基酸影响聚合酶活性无正相关性。综上,本研究证实:VP1蛋白是影响IBDV致病力的重要因素;VP1N端145-147位氨基酸是影响IBDV致病性的重要分子基础,其分子机制是通过改变VP1的聚合酶活性进而影响到病毒复制;病毒蛋白(VP3)和宿主因子(eIF4AII)均参与调控VP1的聚合酶活性的发挥,eIF4AII通过与IBDVVP1之间的相互作用而抑制VP1聚合酶活性,进而限制IBDV的复制,是宿主抵抗病毒感染的天然防御因子之一。
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