本论文包括两部分研究工作:1、褪黑素血药浓度测定方法的建立与评价;2、褪黑素缓释片在中国健康志愿者中药代动力学的研究。本部分新颖之处在于:1、首次报道了褪黑素缓释片在中国健康受试者体内2、4、8mg三个剂量组的单次给药和2 mg连续给药的药代动力学参数。2、首次研究性别、高脂高热量饮食对褪黑素缓释片在中国健康受试者体内的药动学行为的影响。目的:通过研究中国健康志愿者中褪黑素缓释片的药代动力学特征,探讨性别、饮食等对褪黑素缓释片药动学的影响,为临床合理使用褪黑素缓释片提供依据。样品处理方法:本吸取200 μL含药血浆至1.5 mL塑料离心管中,加入50 μL内标工作液,涡旋混匀后加入1.0 111L乙酸乙酯,涡旋3 min,于15000 rpm、4℃离心10 min。取尽上清液至另一1.5 mL塑料离心管中,在真空浓缩仪中以40℃离心30 min挥干溶剂,再加入300 μL溶样流动相(0.1%甲酸水溶液:甲醇(56:44)),涡旋2 min,于15000 rpm、4℃离心10 min,取150 μL上清液至进样瓶中,进样40 μ测定褪黑素浓度。样品检测方法:色谱条件:选用WATERS公司Xterra(?)RP18(4.6×100 mm,3.5μm)色谱柱,Phenomenex Security Guard TM C18(4 ×3.0 mm)预柱。流动相由水相(0.1%甲酸水溶液):甲醇组成,0-3.0 min,水相:甲醇(56:44);3.1-4.1 min,水相:甲醇(5:95);4.2-7.0min,甲醇:水相(56:44);切换阀控制流动相在2.5-5.5min进入质谱系统,柱温为40℃,流速为700 μL/min,每个样本的分析时间为7.0 min,进样体积为40 μL。质谱条件:选用电喷雾(ESI)离子源,在正离子电离模式下,采用多反应监测(MRM)的质谱扫描方式,测定褪黑素和内标(Melatonin-D7)的检测离子分别为:m/z 233.1→174.1 和 m/z 240.2→178.0。方法学验证结果:本试验所建立的测定血浆样本中褪黑素浓度的LC-MS/MS法具有良好的特异性、准确性、精密度和灵敏度。空白血浆中杂质峰不影响测定的准确度。在选定的LC-MS/MS条件下,褪黑素和内标的保留时间较稳定,仪器响应符合试验要求,方法的系统适应性良好。本方法中褪黑素的LLOQ为0.02000 ng/mL,血浆中褪黑素浓度在0.02000～30.00 ng/mL范围内,浓度与峰面积的比值具有良好的线性关系,r值均在0.9989～0.9997之间。本方法测定的低浓度(0.04000 ng/mL)质控样本实测浓度的批内RSD为2.9%,批间RSD为17.1%,RE在-4.7%～18.8%范围内;中浓度(1.200 ng/mL)质控样本实测浓度的批内RSD为1.5%,批间RSD为1.9%,RE在1.9%～6.7%范围内;高浓度(24.00 ng/mL)质控样本实测浓度的批内RSD为2.5%,批间RSD为7.8%,RE在-4.8%～4.5%范围内,即方法的批内和批间精密度与准确度均在可接受范围内。褪黑素储备液于室温放置56 h和冷藏柜中保存43天后仍稳定。褪黑素低、中、高浓度血浆质控样本于室温放置6 h、反复冻融3次(设定温度-30℃)及冰箱(设定温度-30℃)冰冻保存22天和31天的情况下均稳定。复溶上清液于室温放置8h的情况下稳定。待测样本于自动进样器(4℃)放置27h的情况下稳定。褪黑素低、中、高三个浓度血浆质控样本的平均提取回收率分别为65.0%、59.0%、63.6%,RSD 在 4.4%～6.5%,内标平均提取回收率为 64.8%,RSD 为 6.0%,即低、中、高三个浓度的质控样本中褪黑素的提取回收率相近,提取回收率考察结果精密且可重现。褪黑素低、中、高三个浓度血浆质控样本的平均基质效应分别为95.5%、97.7%、98.9%,RSD 在 1.3%～2.5%,内标平均提取回收率为 98.4%,RSD为2.7%,即不同来源的血浆基质对褪黑素和内标产生的基质效应接近。浓度超出定量上限的褪黑素血浆样本经空白血浆稀释10倍后可准确测定。系统的残留效应在可接受范围内,不影响测定准确度。单次空腹给药药代动力学结果:受试者单次空腹口服褪黑素缓释片2、4、8 mg后,褪黑素的药动学参数分别如下:AUC0-10h分别为(4.693±2.206)ng/mL·h、(5.202±4.833)ng/mL·h、(11.09±10.00)ng/mL·h,AUCo-∞分别为(4.981±2.454)ng/mL h、(5.413±5.003)ng/mL h、(12.05± 11.16)ng/mL h,Cmax分别为(1.396±0.685)ng/mL、(1.598±1.600)ng/mL、(3.480 ±3.137)ng/mL,t1/2分别为(2.53±1.10)h、(1.95±0.51)h、(3.11±1.90)h,Tmax分别为(1.28±0.85)h、(0.98±0.61)h、(0.96±0.63)h,Vd 分别为(2367±2922)L、(3343±2281)L、(4472±3439)L,CL/F 分别为(645.2±728.0)L/h、(1261±884)L/h、(1130±726)L/h。多次空腹给药药代动力学研究结果:10名健康受试者多次空腹口服褪黑素缓释片2mg,以给药间隔τ = 24h计,稳态平均血药浓度为(0.259±0.118)ng/mL,稳态血药浓度波动度 DF 为(6.749±1.202),Ro 为(1.510±0.793),Rs为(1.414±0.689)。达稳态后褪黑素的 AUC0-10h 为(6.210±2.836)ng/mL·h,AUC0-∞为(6.538±2.975)ng/mL·h,Cmax为(1.853±1.008)ng/mL,t1/2为(2.39±0.54)h,Tmax为(0.85±0.60)h,Vd 为(1279±564)L,CL/F 为(407.4±265.0)L/h。餐后单次给药药代动力学结果:10名健康受试者餐后单次口服褪黑素缓释片2 mg,褪黑素的 AUC0-10h为(4.090±1.58)ng/mL·h,AUC0-∞为(4.321±1.636)ng/mL h,Cmax为(1.127±0.381)ng/mL,t1/2(2.39±0.54)h,Tmax为(2.28±1.52)h,Vd 为(2002±1427)L,CL/F 为(585.0±396.2)L/h。剂量、给药次数、饮食、性别对药动学参数的影响结果:①2-8 mg剂量范围内lnAUC0-10h、lnAUC0-∞、lnCmax与lndose呈线性相关关系,建立的回归方程有效(P<0.05),回归系数R均小于0.4,虽然呈线性相关关系,但相关程度较弱。剂量组间的MRT0-t、MRT0-∞、t1/2、Vd、CL/F、Tmax均无显著性差异(P>0.05)。②低剂量组的10位受试者多次口服2 mg褪黑素缓释片后的AUC0-10h、AUC0-∞比单次给药大,且具有显著性差异(P<0.05),多次给药后的ln Cmax、t1/2、Vd、CL/F、Tmax无显著性差异(P>0.05)。R0和Rs均在0.8～1.2范围之外,说明受试者连续服用2 mg褪黑素缓释片(τ = 24h)在体内存在轻微的蓄积作用。③低剂量组的10位受试者餐后和空腹单次口服2 mg褪黑素缓释片后,餐后给药的AUC0-10h、AUCo-∞、Cmax比空腹给药小,均不在80%～125%范围内。餐后给药的Tmax比空腹给药有所延迟,且有显著性差异(P<0.05)。④各剂量组不同性别受试者的药动学参数通过对男女分组进行统计分析,除MRT、CL/F外,均无显著性差异(P>0.05)。结论:2mg～8mg剂量范围内,褪黑素缓释片在健康受试者体内呈线性药动学特征。受试者连续服用2 mg褪黑素缓释片(τ= 24h)在体内存在轻微的蓄积作用,多次给药可增加褪黑素在体内的吸收程度,但不影响其吸收和代谢速度。食物可降低褪黑素在体内的吸收程度,并延迟吸收速度。性别对药动学参数有影响。