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目的:
针灸在临床应用治疗焦虑症时多使用百会及印堂穴，但其作用机制尚不明确。本研究拟使用慢性不可预计性温和刺激(CUMS)模型小鼠研究电针百会、印堂治疗焦虑症的作用机制，寻找电针作用的关键靶点。然后利用药理学及基因敲除动物进一步验证上述电针所发现的靶点。为电针治疗焦虑症提供理论依据，也为焦虑症的治疗提供新的研究思路。
方法:
1.动物分组
(1)应用CUMS模型观察电针百会、印堂对焦虑样行为的改善作用
为了观察电针对CUMS小鼠焦虑样行为的作用，该部分实验将48只7-8周龄体重21.43±1.49克的雄性C57/BL6小鼠按随机数法分为4组:对照组(n=12)，电针组(n=12)，模型组(n=12)，模型+电针组(n=12)。
(2)采用药理学方法及NOX2基因敲除小鼠验证上述电针作用位点在焦虑中的作用
由于电针能够调节腹侧海马CA1区(vCA1)中的氧化应激水平，该部分实验采用夹竹桃麻素(apocynin)验证vCA1氧化应激在CUMS所导致焦虑中的作用。将48只7-8周龄体重22.05±0.93克的雄性C57/BL6小鼠按随机数法分为4组:空白组(n=12)，药物组(n=12)，模型组(n=12)，模型+药物组(n=12)。
为了探宄CUMS所引起的氧化应激的来源，该阶段实验将32只7周龄左右体重22.19±0.92克的雄性NOX2基因敲除(NOX2KO)小鼠(包含16只纯合子小鼠及16只野生型小鼠)按随机数法分为4组:WT空白组(n=8)，NOX2KO组(n=8)，WT模型组(n=8)，NOX2KO+模型组(n=8)。
2.CUMS模型制备
所有实验动物均在进行一周的适应性饲养之后开始进行CUMS模型的制备。需要造模的小鼠分组有:模型组和模型+电针组;模型组和模型+药物组;WT模型组和NOX2KO+模型组。整个CUMS造模过程持续3周，在该阶段，小鼠每天会被实施1-3种不同类型的刺激，包括束缚、强迫温水浴、湿垫料饲养、昼夜颠倒、禁水及禁食等。造模期间所有实验动物均为群体饲养(每笼4只小鼠)。
3.干预措施
(1)电针干预
使用异氟烷诱导麻醉小鼠后，维持麻醉并将小鼠置于32℃的加热垫上，根据《实验针灸学》在小鼠“百会”、“印堂”两穴针刺并使用电针仪进行电针治疗(连续波，2Hz，1mA，疗程1周，隔天1次，每次治疗持续30min)。
(2)Apocynin干预
我们采用口服给药的方式对小鼠进行apocynin给药，每只小鼠的给药量大约为5mg/kg/day。给药方法为，将apocynin溶于双蒸水配成浓度为0.75mmol/升的溶液，并装入有容量刻度的饮水瓶中，由小鼠在进行日常饮水的过程中进行摄入。需要进行药物干预的分组有对照+药物组和模型+药物组。在apocynin干预期间，每日对每个饮水瓶进行称重，以估算小鼠每日摄入的apocynin药量。
4.行为学检测及评价
(1)焦虑相关行为学检测
在进行行为学测试之前，需对待进行测试的小鼠按照完全随机的原则安排实验顺序，并在行为学测试开始前1小时转移到测试房间进行环境适应。本研究通过旷场实验(OFT)、高架十字迷宫实验(EPM)以及明暗箱实验(LDB)观察了小鼠在威胁区域的探索时间，以评价小鼠的焦虑程度;并通过观察小鼠在糖水偏好实验(SPT)及强迫游泳实验(OFT)的行为表现来评价小鼠的抑郁程度。
5.氧化应激水平检测
超氧化物阴离子荧光探针(DHE)检测:先对小鼠经腹腔注射DHE溶液(2 mg/kg)，并于1小时之后，使用1％戊巴比妥钠深度麻醉小鼠并分别使用4％多聚甲醛溶液与PBS缓冲液进行心脏灌注，取出大脑。使用冰冻切片机将其切为20μm切片，并于阴暗处晒干。经PBS缓冲液清洗后，使用激光共聚焦显微镜观察染色结果。
丙二醛(MDA)检测:经麻醉、生理盐水灌注之后，取出相应的脑样本，并依照MDA试剂盒说明对小鼠脑样本进行处理。采用紫外分光光度计在532nm波长下读取数据，并计算MDA含量。
6.免疫荧光检测
深度麻醉小鼠，并分别使用0.9％生理盐水和4％多聚甲醛溶液进行心脏灌注，并取脑。对脑样本进行固定、脱水之后，使用冰冻切片机将其切为40μm切片。分别使用R抗Iba-1及M抗NOX2作为一抗，以488G抗R以及594G抗M作为二抗处理，孵育完成后使用DAPI标记细胞核。使用激光共聚焦显微镜观察并拍摄样本的免疫荧光染色。
7.实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测
深度麻醉小鼠后，使用0.9％生理盐水进行心脏灌注，并取脑，分离待检测的脑区或核团。总RNA的提取及逆转录使用试剂盒进行。最后检测样本的基因表达量。
8.统计学方法
使用SPSS19.0软件对所有数据进行统计分析，并以(X)±S表示。采用双因素方差分析法分析不同处理因素的效应，并采用LSD事后检验法分析各组之间的差异。以检验统计量α=0.05为检验标准来评价结果是否具有显著性差异。
成果:
1.应用CUMS模型观察电针百会、印堂对小鼠焦虑样行为的改善作用
为了研究电针是否具有抗焦虑作用，我们运用了CUMS来制备焦虑模型，并选取百会、印堂两穴进行电针刺激来观察小鼠焦虑样行为的变化。研究发现，模型组小鼠在旷场中央区及高架十字迷宫开臂的探索时间都比对照组小鼠明显减少(P＜0.01)。此外，经过电针干预的CUMS小鼠在旷场中央区及高架十字迷宫开臂的探索时间都比未经过电针干预的CUMS小鼠明显增加(P＜0.05)。对于未进行CUMS造模的小鼠，电针并未对其在旷场实验或高架十字迷宫实验中所表现出的行为产生任何明显差异(P＞0.05)。
2.电针百会、印堂对CUMS小鼠vCA1椎体神经元兴奋性突触传递的影响
为了进一步探究电针抗焦虑的作用机理，我们观察了电针和CUMS对vCA1椎体神经元(近期研究认为与焦虑行为密切相关的神经元)的兴奋/抑制性平衡的变化。研究发现，CUMS小鼠vCA1椎体神经元的sEPSC频率、sEPSC电荷量及E/I比值明显比对照组小鼠明显增高(P＜0.01)。此外，无论电针或是CUMS均未对vCA1椎体神经元的sEPSC幅度、sIPSC频率、sIPSC幅度和sIPSC电荷量造成明显影响(P＞0.05)。
3.电针百会、印堂对CUMS小鼠vCA1氧化应激水平的调节作用
为了探究vCA1椎体神经元的兴奋性突触传递变化是否与氧化应激相关，我们通过DHE染色及MDA检测观察了各组小鼠vCA1区的氧化应激水平。研究发现，CUMS小鼠vCA1区DHE荧光密度及MDA含量都比对照组小鼠明显增高(P＜0.01)，而电针干预明显改善了因CUMS而增加的DHE荧光密度(P＜0.05)及MDA含量(P＜0.01)。此外，我们还发现CUMS并未明显影响dCA1或mPFC的氧化应激水平(P＞0.05)。
4.电针百会、印堂对CUMS小鼠vCA1区NOX2表达水平的调节作用
为了进一步探究NOX2是否CUMS引起的vCA1氧化应激的主要来源，我们通过qPCR检测了vHPC的Nox2mRNA表达量，并采用免疫荧光染色标记NOX2及小胶质细胞(NOX2在CNS中主要表达的细胞类型)。研究发现，CUMS明显升高了vHPC的Nox2mRNA表达量(P＜0.01)、vCA1的NOX2阳性细胞数量(P＜0.01)及小胶质细胞数量(P＜0.01)，而电针干预明显改善了上述因CUMS而引起变化(P＜0.05)。
5.采用药理学及基因敲除小鼠对上述电针作用位点在焦虑中发挥的作用进行验证
尽管电针百会、印堂对CUMS小鼠产生了抗焦虑作用，并且抑制了CUMS引起的氧化应激，但氧化应激水平增高是否是CUMS所致焦虑的主要病因尚不明确。为了进一步验证氧化应激与CUMS所致焦虑的关系，我们采用了apocynin来观察抑制氧化应激水平对CUMS小鼠的影响。研究发现，经过apocynin干预的CUMS小鼠，其在旷场中央区及高架迷宫开臂的探索时间都较未干预的CUMS小鼠明显增加(P＜0.01)，并且vCA1锥体神经元的sEPSC频率也明显下降(P＜0.01)，此外。经过apocynin干预的小鼠其vCA1区的氧化应激水平及NOX2表达水平均明显降低(P＜0.01)。
为了进一步验证NOX2是否为CUMS所引起的vCA1氧化应激的主要来源，我们观察了CUMS对NOX2KO小鼠的效果。研究发现，CUMS造模后，NOX2KO小鼠的vCA1中的氧化应激水平明显低于WT小鼠(P＜0.01)。此外，CUMS造模后，NOX2KO小鼠在旷场中央区及高架迷宫开臂的探索时间均明显高于WT小鼠(P＜0.01)。
结论:
1.电针百会、印堂能够改善CUMS小鼠的焦虑样行为;
2.电针百会、印堂能够调节腹侧海马CA1区椎体神经元的兴奋性突触传递，并进而影响其兴奋/抑制平衡;
3.电针百会、印堂能够通过调节CUMS小鼠的NOX2表达抑制氧化应激水平;
4.通过药理学或基因敲除手段抑制NOX2，均能改善CUMS所导致的氧化应激及焦虑样行为。
因此，我们的结果提示，NOX2介导的氧化应激可能在CUMS导致的焦虑中发挥总要作用，而电针可能通过抑制NOX2介导的氧化应激，进而调节vCA1区椎体神经元的兴奋性/抑制性突触传递，从而改善了CUMS所导致的焦虑样行为。
针灸在临床应用治疗焦虑症时多使用百会及印堂穴，但其作用机制尚不明确。本研究拟使用慢性不可预计性温和刺激(CUMS)模型小鼠研究电针百会、印堂治疗焦虑症的作用机制，寻找电针作用的关键靶点。然后利用药理学及基因敲除动物进一步验证上述电针所发现的靶点。为电针治疗焦虑症提供理论依据，也为焦虑症的治疗提供新的研究思路。
方法:
1.动物分组
(1)应用CUMS模型观察电针百会、印堂对焦虑样行为的改善作用
为了观察电针对CUMS小鼠焦虑样行为的作用，该部分实验将48只7-8周龄体重21.43±1.49克的雄性C57/BL6小鼠按随机数法分为4组:对照组(n=12)，电针组(n=12)，模型组(n=12)，模型+电针组(n=12)。
(2)采用药理学方法及NOX2基因敲除小鼠验证上述电针作用位点在焦虑中的作用
由于电针能够调节腹侧海马CA1区(vCA1)中的氧化应激水平，该部分实验采用夹竹桃麻素(apocynin)验证vCA1氧化应激在CUMS所导致焦虑中的作用。将48只7-8周龄体重22.05±0.93克的雄性C57/BL6小鼠按随机数法分为4组:空白组(n=12)，药物组(n=12)，模型组(n=12)，模型+药物组(n=12)。
为了探宄CUMS所引起的氧化应激的来源，该阶段实验将32只7周龄左右体重22.19±0.92克的雄性NOX2基因敲除(NOX2KO)小鼠(包含16只纯合子小鼠及16只野生型小鼠)按随机数法分为4组:WT空白组(n=8)，NOX2KO组(n=8)，WT模型组(n=8)，NOX2KO+模型组(n=8)。
2.CUMS模型制备
所有实验动物均在进行一周的适应性饲养之后开始进行CUMS模型的制备。需要造模的小鼠分组有:模型组和模型+电针组;模型组和模型+药物组;WT模型组和NOX2KO+模型组。整个CUMS造模过程持续3周，在该阶段，小鼠每天会被实施1-3种不同类型的刺激，包括束缚、强迫温水浴、湿垫料饲养、昼夜颠倒、禁水及禁食等。造模期间所有实验动物均为群体饲养(每笼4只小鼠)。
3.干预措施
(1)电针干预
使用异氟烷诱导麻醉小鼠后，维持麻醉并将小鼠置于32℃的加热垫上，根据《实验针灸学》在小鼠“百会”、“印堂”两穴针刺并使用电针仪进行电针治疗(连续波，2Hz，1mA，疗程1周，隔天1次，每次治疗持续30min)。
(2)Apocynin干预
我们采用口服给药的方式对小鼠进行apocynin给药，每只小鼠的给药量大约为5mg/kg/day。给药方法为，将apocynin溶于双蒸水配成浓度为0.75mmol/升的溶液，并装入有容量刻度的饮水瓶中，由小鼠在进行日常饮水的过程中进行摄入。需要进行药物干预的分组有对照+药物组和模型+药物组。在apocynin干预期间，每日对每个饮水瓶进行称重，以估算小鼠每日摄入的apocynin药量。
4.行为学检测及评价
(1)焦虑相关行为学检测
在进行行为学测试之前，需对待进行测试的小鼠按照完全随机的原则安排实验顺序，并在行为学测试开始前1小时转移到测试房间进行环境适应。本研究通过旷场实验(OFT)、高架十字迷宫实验(EPM)以及明暗箱实验(LDB)观察了小鼠在威胁区域的探索时间，以评价小鼠的焦虑程度;并通过观察小鼠在糖水偏好实验(SPT)及强迫游泳实验(OFT)的行为表现来评价小鼠的抑郁程度。
5.氧化应激水平检测
超氧化物阴离子荧光探针(DHE)检测:先对小鼠经腹腔注射DHE溶液(2 mg/kg)，并于1小时之后，使用1％戊巴比妥钠深度麻醉小鼠并分别使用4％多聚甲醛溶液与PBS缓冲液进行心脏灌注，取出大脑。使用冰冻切片机将其切为20μm切片，并于阴暗处晒干。经PBS缓冲液清洗后，使用激光共聚焦显微镜观察染色结果。
丙二醛(MDA)检测:经麻醉、生理盐水灌注之后，取出相应的脑样本，并依照MDA试剂盒说明对小鼠脑样本进行处理。采用紫外分光光度计在532nm波长下读取数据，并计算MDA含量。
6.免疫荧光检测
深度麻醉小鼠，并分别使用0.9％生理盐水和4％多聚甲醛溶液进行心脏灌注，并取脑。对脑样本进行固定、脱水之后，使用冰冻切片机将其切为40μm切片。分别使用R抗Iba-1及M抗NOX2作为一抗，以488G抗R以及594G抗M作为二抗处理，孵育完成后使用DAPI标记细胞核。使用激光共聚焦显微镜观察并拍摄样本的免疫荧光染色。
7.实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测
深度麻醉小鼠后，使用0.9％生理盐水进行心脏灌注，并取脑，分离待检测的脑区或核团。总RNA的提取及逆转录使用试剂盒进行。最后检测样本的基因表达量。
8.统计学方法
使用SPSS19.0软件对所有数据进行统计分析，并以(X)±S表示。采用双因素方差分析法分析不同处理因素的效应，并采用LSD事后检验法分析各组之间的差异。以检验统计量α=0.05为检验标准来评价结果是否具有显著性差异。
成果:
1.应用CUMS模型观察电针百会、印堂对小鼠焦虑样行为的改善作用
为了研究电针是否具有抗焦虑作用，我们运用了CUMS来制备焦虑模型，并选取百会、印堂两穴进行电针刺激来观察小鼠焦虑样行为的变化。研究发现，模型组小鼠在旷场中央区及高架十字迷宫开臂的探索时间都比对照组小鼠明显减少(P＜0.01)。此外，经过电针干预的CUMS小鼠在旷场中央区及高架十字迷宫开臂的探索时间都比未经过电针干预的CUMS小鼠明显增加(P＜0.05)。对于未进行CUMS造模的小鼠，电针并未对其在旷场实验或高架十字迷宫实验中所表现出的行为产生任何明显差异(P＞0.05)。
2.电针百会、印堂对CUMS小鼠vCA1椎体神经元兴奋性突触传递的影响
为了进一步探究电针抗焦虑的作用机理，我们观察了电针和CUMS对vCA1椎体神经元(近期研究认为与焦虑行为密切相关的神经元)的兴奋/抑制性平衡的变化。研究发现，CUMS小鼠vCA1椎体神经元的sEPSC频率、sEPSC电荷量及E/I比值明显比对照组小鼠明显增高(P＜0.01)。此外，无论电针或是CUMS均未对vCA1椎体神经元的sEPSC幅度、sIPSC频率、sIPSC幅度和sIPSC电荷量造成明显影响(P＞0.05)。
3.电针百会、印堂对CUMS小鼠vCA1氧化应激水平的调节作用
为了探究vCA1椎体神经元的兴奋性突触传递变化是否与氧化应激相关，我们通过DHE染色及MDA检测观察了各组小鼠vCA1区的氧化应激水平。研究发现，CUMS小鼠vCA1区DHE荧光密度及MDA含量都比对照组小鼠明显增高(P＜0.01)，而电针干预明显改善了因CUMS而增加的DHE荧光密度(P＜0.05)及MDA含量(P＜0.01)。此外，我们还发现CUMS并未明显影响dCA1或mPFC的氧化应激水平(P＞0.05)。
4.电针百会、印堂对CUMS小鼠vCA1区NOX2表达水平的调节作用
为了进一步探究NOX2是否CUMS引起的vCA1氧化应激的主要来源，我们通过qPCR检测了vHPC的Nox2mRNA表达量，并采用免疫荧光染色标记NOX2及小胶质细胞(NOX2在CNS中主要表达的细胞类型)。研究发现，CUMS明显升高了vHPC的Nox2mRNA表达量(P＜0.01)、vCA1的NOX2阳性细胞数量(P＜0.01)及小胶质细胞数量(P＜0.01)，而电针干预明显改善了上述因CUMS而引起变化(P＜0.05)。
5.采用药理学及基因敲除小鼠对上述电针作用位点在焦虑中发挥的作用进行验证
尽管电针百会、印堂对CUMS小鼠产生了抗焦虑作用，并且抑制了CUMS引起的氧化应激，但氧化应激水平增高是否是CUMS所致焦虑的主要病因尚不明确。为了进一步验证氧化应激与CUMS所致焦虑的关系，我们采用了apocynin来观察抑制氧化应激水平对CUMS小鼠的影响。研究发现，经过apocynin干预的CUMS小鼠，其在旷场中央区及高架迷宫开臂的探索时间都较未干预的CUMS小鼠明显增加(P＜0.01)，并且vCA1锥体神经元的sEPSC频率也明显下降(P＜0.01)，此外。经过apocynin干预的小鼠其vCA1区的氧化应激水平及NOX2表达水平均明显降低(P＜0.01)。
为了进一步验证NOX2是否为CUMS所引起的vCA1氧化应激的主要来源，我们观察了CUMS对NOX2KO小鼠的效果。研究发现，CUMS造模后，NOX2KO小鼠的vCA1中的氧化应激水平明显低于WT小鼠(P＜0.01)。此外，CUMS造模后，NOX2KO小鼠在旷场中央区及高架迷宫开臂的探索时间均明显高于WT小鼠(P＜0.01)。
结论:
1.电针百会、印堂能够改善CUMS小鼠的焦虑样行为;
2.电针百会、印堂能够调节腹侧海马CA1区椎体神经元的兴奋性突触传递，并进而影响其兴奋/抑制平衡;
3.电针百会、印堂能够通过调节CUMS小鼠的NOX2表达抑制氧化应激水平;
4.通过药理学或基因敲除手段抑制NOX2，均能改善CUMS所导致的氧化应激及焦虑样行为。
因此，我们的结果提示，NOX2介导的氧化应激可能在CUMS导致的焦虑中发挥总要作用，而电针可能通过抑制NOX2介导的氧化应激，进而调节vCA1区椎体神经元的兴奋性/抑制性突触传递，从而改善了CUMS所导致的焦虑样行为。