论文部分内容阅读
研究背景强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)主要表现为骶髂和中轴关节为主的慢性进行性炎症性关节病,该自身免疫性关节炎的主要疾病特点表现为为骶髂、外周关节和脊柱关节骨性强直、附着点炎和韧带骨化,最终导致关节功能和活动的慢性丧失以及病理性成骨,这是强直性脊柱炎的主要致残原因,早期若不及时识别和干预,后期会导致较高的致残率,最终严重影响AS患者的生活质量,并给AS患者增加沉重的经济生活负担。目前AS的致病原因尚不明确,大多数研究认为其病因有遗传、环境、感染、免疫等相关因素。国际脊柱关节病评价组织(Assessment of Spondylo Arthritis international Society,ASAS)提出消除炎症是AS达标治疗的关键理念,在控制炎症的同时还必须解决韧带骨化的问题。目前对AS的成骨机制的研究尚不清楚,关于其炎症机制研究也尚不深入。作为不同基因编码的高度保守的蛋白质家族的14-3-3η蛋白,目前暂分为7种亚型。该蛋白可参与细胞生命的多种生理过程,在细胞信号转导、分化、粘附、离子通道的调节以及细胞的生长等发面发挥着至关重要作用,是近年来研究的热点。14-3-3η蛋白可作为桥梁,通过磷酸化和非磷酸化的方式发挥其生理学功能,至少可以结合并调控200多种分子,可参与细胞周期的调控、分化、迁移、凋亡等生命过程,具有极其广泛的生物学功能,越来越多的研究表明14-3-3η蛋白与炎症及成骨相关的信号通路有着密切系。14-3-3η蛋白与凋亡信号调节激酶-1(ASK-1)、有丝分裂原蛋白激酶(MAPK)、基质金属蛋白酶(MMP)以及蛋白激酶C(PKC)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症相关因子和介质均有联系,促进炎症的发生。同时在成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的分化、增殖以及骨损伤修复时14-3-3η蛋白发挥着重要的调节作用和功能。而局部关节的炎症、脊柱、骶髂等关节骨破坏和新骨形成是AS的病理改变的典型表现,在AS长期局部慢性持续性炎症的同时,必然存在着局部成骨因子和相关介质因子的异常表达。14-3-3η蛋白是一种新的促炎介质,其在AS新骨形成中的机制如何?是否与AS的成骨信号通路有关?本研究将通过体外实验探明14-3-3η蛋白能否影响BMSCs中成骨相关蛋白的表达和骨细胞的增殖、14-3-3η蛋白是否通过对MAPK/Smad1分化等一系列实验研究;从而为临床治疗提供新的依据和思路。目的探讨14-3-3η蛋白是否可以通过MAPK信号通路的调控影响骨髓间充质干细胞的成骨分化方法本文通过下调以及上调慢病毒载,以及体外转染狗骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的方法,构建14-3-3η蛋白载体,实现14-3-3η蛋白在细胞中过表达及低表达,采用QRT-PCR和Western-Blo方法检测BMSCs中hif-a、vegf、BMP-2、OPN、ost、Runx2 m RAN的表达和蛋白含量,通过免疫共沉淀研究14-3-3η蛋白与MAPK的结合情况,通过实现miRNA142-3P或miRNA142-3P在BMSCs中的过表达,检测BMSCs中BMP-2和MAPKm RAN的表达和蛋白含量通过划痕实验研究14-3-3η蛋白对骨细胞迁移的影响。结果1.慢病毒载体的构建和体外转染14-3-3η蛋白狗BMSCs后的鉴定:与对照组相比,经sh14-3-3η蛋白转染后的,采用Western-Blot和QRT-PCR和方法测定14-3-3ηm RNA和蛋白水平的表达均显示得到明显的抑制。2.体外培养BMSCs,在BMSCs中敲低14-3-3η蛋白,QRT-PCR检测成骨蛋白hif-a、vegf、BMP-2、OPN、ost、Runx2 m RNA表达,结果发现上述各成骨指标及物质的m RNA水平在第1天、4天、7天、14天、21天表达明显上调,且呈逐渐升高趋势,Western-Blot检测也显示在第1天、4天、7天、14天、21天的hif-a、vegf、BMP-2、OPN、ost、Runx2蛋白的表达水平也是明显上调的,也呈逐渐升高趋势。3.采用划痕实验研究发现敲低14-3-3η蛋白后24h骨细胞迁移和增殖能力是明显增强的。4.体外稳定敲低或过表达14-3-3η蛋白,在诱导骨发生的情况下检测14-3-3η蛋白与MAPK的结合情况,MAPK蛋白的表达水平,并加caspase-3的抑制剂,体外培养BMSCs,敲低或过表达14-3-3η蛋白以及对照组,在低氧环境下诱导BMSCs成骨时,14-3-3η蛋白和MAPK表达下调(P<0.05),Hif-α与BMP-2表达上调(P<0.05),并且14-3-3η蛋白能与MAPK结合减少。敲低14-3-3η蛋白,下调MAPK,成骨蛋白BMP-2表达上调;当加入caspase3抑制剂Ac-DEVD-CHO时,再次敲低14-3-3η蛋白,MAPK未被caspase3裂解,成骨蛋白BMP-2表达无上调。5.在过表达miR-142-3P时,Western-Blot结果显示14-3-3η蛋白和MAPK水平较对照组下调,成骨蛋白BMP-2较对照组表达上调;同时14-3-3η的m RNA水平较对照组下调,而miR-142-3P的m RNA较对照组上调。同时miR-142-3P表达抑制的模型被构建时,Western-Blot结果显示14-3-3η蛋白和MAPK水平较实验对照组出现上调,成骨蛋白BMP-2较对照组表达下调;同时水平较对照组上调的是14-3-3η的m RNA,而miR-142-3P的m RNA较对照组下调。结论1.通过激活MAPK信号通路14-3-3η蛋白能明显抑制BMSCs的成骨分化作用;2.miRNA142-3P可经过对14-3-3η蛋白发挥抑制作用,抑制BMSCs的成骨分化过程。