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γ-癸内酯是一种食品添加剂,其主要用于配制奶油、草莓、桃子、柑橘和椰子等香料的内酯类香味化合物,具有很浓郁的香气,是国际公认安全的食品添加剂和药品添加剂。由微生物发酵生产得到的γ-癸内酯在香料工业中被誉为“天然”的香料。许多微生物都能利用底物蓖麻油酸发酵生产γ-癸内酯,然而在众多能产γ-癸内酯的菌株中,解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica发酵生产γ-癸内酯的量比较高。本文以解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica AS2.1045为出发菌株,对其进行分子生物学改造,使其高产γ-癸内酯。主要实验内容及结论如下:为了构建高产γ-癸内酯的营养缺陷型Yarrowia lipolytica酵母菌,首先利用基因同源重组的方法敲除掉尿嘧啶合成酶关键基因URA3基因,用尿嘧啶营养缺陷型培养基(SD-URA)添加一定浓度的5-氟乳清酸(5-FOA)和尿嘧啶筛选获得转化子。得到的尿嘧啶营养缺陷型菌株,当菌株生长达到一定浓度后,可以在不含有尿嘧啶的发酵培养基中,抑制蓖麻油酸的一个旁路代谢途径和细胞生长,使其转回内酯的合成途径,从而提高香味物质γ-癸内酯产量。因此尿嘧啶含量则成为影响营养缺陷型菌株发酵生产γ-癸内酯的最关键因素。在获得了营养缺陷型菌株后,对营养缺陷型菌株和野生型菌株进行了含尿嘧啶培养基发酵条件的优化,最终得到了营养缺陷型菌株发酵γ-癸内酯产量的最佳条件:蓖麻油5%,蛋白胨0.5%,吐温-80 0.4%,酵母浸膏0.25%,MgSO4?7H2O 0.3%,NaCl 0.5%,尿嘧啶添加量为5ng/μl.然后在最佳条件下对比野生型菌株和营养缺陷型菌株的发酵产量。在58h左右,原始菌株产γ-癸内酯的量达到最大值199.3 mg/L,而缺陷型菌株在63h时达到最大量为1032.9mg/L。其次利用酵母本身的铜抗性基因CRF1的自克隆作为筛选标记,将CRF1基因插入POX3基因内部,替换掉POX3基因内部一部分序列,然后将构建的POX3基因敲除组件pMPC1转化酵母Yarrowia lipolytica AS2.1045,敲除掉影响γ-癸内酯产量的关键基因POX3基因。由于铜抗性基因CRF1的自克隆表达,使转化子菌株获得铜抗性,达到了11mM硫酸铜浓度,然而野生型不能在含此硫酸铜浓度的培养基上生长。通过对转化子和野生型酵母菌目的基因进行PCR扩增测序,从而验证得到了敲除POX3基因的工业生产菌株TA1。对获得的敲除掉POX3基因的菌株TA1进行发酵培养基优化条件,首先对碳源、氮源、发酵温度、pH值、接种量、装液量进行了单因素条件优化,然后又对碳源、发酵温度、pH值、接种量进行了四因素三水平的正交实验分析。从而得到了最佳发酵培养条件:蓖麻油5%、酵母浸膏0.25%、蛋白胨0.5%、吐温-80 0.4%、MgSO4?7H2O 0.3%、NaCl 0.5%、pH值7.0、接种量8%(菌液浓度为1.6×107个/mL),250 mL三角瓶中装液量115mL,温度28℃,转速150r/min。在最佳发酵培养条件下,进行转化子TA1和野生型菌株的发酵培养,在60h左右,POX3基因敲除菌株TA1最大产量为630.9mg/l,而野生型菌株仅为199.7mg/l,在POX3基因敲出后,产量提高了2.13倍。由此得到更高产量的高产菌株TA1。该菌株传代50次后产量很稳定。以此确定得到了高产γ-癸内酯的工业菌株。