紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是一种天然抗肿瘤药物,广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗。由于紫杉醇溶解性较差,其注射液泰素中使用了大量聚氧乙烯蓖麻油和乙醇助溶,临床使用过程中会导致严重的过敏反应。近年来纳米制剂飞速发展,介孔二氧化硅纳米粒子(Mesoporous silica nanoparticles,MSNs)由于具有载药量高、生物相容性好、表面易于修饰等特点,在众多纳米材料中脱颖而出。目前,介孔二氧化硅的表面修饰和功能化研究取得了突破性进展。通过表面修饰,构造靶向定位、控制释放的智能药物递送系统,实现抗癌药物“减毒增效”的愿景。目的:为了提高紫杉醇对肿瘤细胞的药效并降低对正常细胞的副作用,本研究合成了能够特异性识别在肿瘤细胞表面过表达叶酸受体、整合素αvβ3的叶酸、RGD肽双靶向介孔二氧化硅纳米粒子MSNs-NH2-FA-RGD,通过浸渍法制备了载紫杉醇双靶向介孔二氧化硅纳米粒子PTX@MSNs-NH2-FA-RGD。采用体外细胞实验对纳米粒子的靶向性、安全性和体外药效进行评价,以期为临床应用提供理论和实验基础。方法:双靶向纳米粒子MSNs-NH2-FA-RGD的制备与表征:以十六烷基三甲基溴化铵为模板剂,正硅酸四乙酯为硅源,溶液搅拌反应后抽滤,将抽滤得到的固体置于马弗炉内煅烧,即得介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)。通过与硅烷偶联剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷反应,引入活性氨基,得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs-NH2)。叶酸靶向基团(NHS-PEG-FA)与MSN-NH2发生酰胺化反应,生成叶酸单靶向纳米粒子(MSNs-NH2-FA)。基于相同的原理,MSNs-NH2-FA与RGD肽靶向基团(NHS-PEG-RGD)反应,生成叶酸、RGD肽双靶向介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs-NH2-FA-RGD)。采用透射电镜、氮气吸附、红外光谱、激光粒度测定仪和热重分析等方法对制得的纳米粒子进行表征。载紫杉醇纳米粒子PTX@MSNs-NH2-FA-RGD的制备:实验通过高效液相色谱建立了紫杉醇的含量测定方法。采用浸渍法制备载紫杉醇纳米粒子(PTX@MSNs-NH2-FA-RGD),并通过比较载药量和包封率,筛选最佳的载药条件。细胞摄取实验:实验制备了载罗丹明(RhB)的荧光纳米粒子,分别记为RhB@MSNs-NH2、RhB@MSNs-NH2-FA 和 RhB@MSNs-NH2-FA-RGD。选取人乳腺上皮MCF-10A细胞(细胞表面叶酸受体、整合素αvβ3均不表达)、人宫颈癌HeLa细胞(细胞表面叶酸受体高表达、整合素αvβ3不表达)和人乳腺癌MCF-7细胞(细胞表面叶酸受体、整合素αvβ3均高表达)为实验对象。将处于对数生长期的HeLa、MCF-7和MCF-10A细胞接种于细胞爬片,细胞培养贴壁后,每孔加入1 mL含20 μg上述荧光纳米粒子的完全培养基。培养4 h后,吸出培养基,并用PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗。使用4%多聚甲醛固定细胞形态,DAPI染液、Lysotracker荧光探针染液对细胞核、细胞质进行染色。PBS磷酸盐缓冲溶液洗去多余的染液后,通过荧光显微镜观察上述三种细胞对荧光纳米粒子的摄取情况。空白纳米粒子的细胞毒性:实验考察了空白纳米粒子MSNs-NH2-FA-RGD对MCF-7细胞和MCF-10A细胞的毒性作用。收集处于对数生长期的MCF-7细胞和MCF-10A细胞,分别以每孔6×104细胞·mL-1和1.5×105细胞·mL-1的细胞密度接种于96孔板中。细胞培养贴壁后,每孔加入100 μL含不同浓度MSNs-NH2-FA-RGD(0、10、20、40、80、160μg·mL-1)的完全培养基,在恒温培养箱中孵育24 h或48 h。每孔加入2 μL CCK-8溶液,细胞放于恒温培养箱中继续孵育2 h,酶标仪测定各孔在450 nm下的OD值。载药纳米粒子的细胞毒性:为比较游离PTX和载药纳米粒子PTX@MSNs-NH2-FA-RGD对MCF-7细胞的抑制作用,收集处于对数生长期的MCF-7细胞,以每孔6×104细胞·mL-1的细胞密度接种于96孔板中。细胞培养贴壁后,每孔加入100 μL含不同浓度的PTX和载药纳米粒子PTX@MSNs-NH2-FA-RGD(折合 PTX 的浓度为0、10、30、100、300、1000 ng·mL-1)的完全培养基,在恒温培养箱中孵育24 h或48 h。每孔加入2μL CCK-8溶液,细胞放于恒温培养箱中继续孵育2 h,酶标仪测定各孔在450 nm下的OD值。结果:双靶向纳米粒子MSNs-NH2-FA-RGD的表征:透射电镜观察到,MSNs-NH2-FA-RGD呈圆球形,表面光滑,孔道均匀有序。经氨基、叶酸靶向基团和RGD肽靶向基团修饰后,依然可直接观察到介孔结构。氮气吸附结果表明,MSNs具有较大比表面积(1023.41 m2·g-1)、孔径(3.77 nm)和孔体积(1.13 cm3·g-1),修饰后,MSNs-NH2、MSNs-NH2-FA 和 MSNs-NH2-FA-RGD 的比表面积、孔径和孔体积相应减小。经检测,双靶向纳米粒子MSNs-NH2-FA-RGD具有比表面积(426.68 m2·g-1)、孔径(3.03nm)和孔体积(0.40 cm3·g-1)。激光粒度测定仪结果表明,MSNs、MSNs-NH2、MSNs-NH2-FA 和 MSNs-NH2-FA-RGD 的粒径逐渐变大,分别为(131.1±34.64)nm、(168.6±39.44)nm、(191.3±61.52)nm和(229.0±100.90)nm;Zeta电位分别为(-18.4±4.30)mV、(25.6±3.80)mV、(24.4±7.36)mV和(22.9±3.90)mV。红外光谱中检测到代表氨基、酰胺Ⅰ带的特征吸收峰,表明氨基、叶酸靶向基团和RGD肽靶向基团均已成功接枝到MSNs表面。热重分析结果表明,氨基、叶酸靶向基团、RGD肽靶向基团的接枝率分别7.93%、3.87%和4.39%。载紫杉醇纳米粒子PTX@MSNs-NH2-FA-RGD的制备:PTX溶液在27.5～440μg·mL-1呈现良好的线性关系(R2=0.9998),精密度、稳定性和回收率结果良好,满足检测要求。载药实验最终确定以无水乙醇为溶剂,磁力搅拌12 h制备PTX@MSNs-NH2-FA-RGD。PTX@MSNs-NH2-FA-RGD 的载药量为 18.52%±4.17%,包封率为 85.71%±2.91%。细胞摄取实验:通过荧光显微镜观察发现,MCF-10A细胞中没有观察到RhB@MSNs-NH2、RhB@MSNs-NH2-FA、RhB@MSNs-NH2-FA-RGD 的红色荧光,表明MCF-10A细胞对以上三种纳米粒子几乎不摄取。在HeLa细胞中观察到,代表RhB@MSNs-NH2-FA和RhB@MSNs-NH2-FA-RGD的红色荧光与绿色荧光区域有重合,表明RhB@MSNs-NH2-FA和RhB@MSNs-NH2-FA-RGD被细胞内吞后分布在HeLa细胞的细胞质中,但两种纳米粒子的荧光强度没有明显区别,没有观察到HeLa细胞对RhB@MSNs-NH2的摄取。相比于RhB@MSNs-NH2,RhB@MSNs-NH2-FA 和 RhB@MSNs-NH2-FA-RGD 在 MCF-7 细胞中均有明显的红色荧光,并且RhB@MSNs-NH2-FA-RGD的荧光强度最强。细胞摄取实验证明,双重靶向修饰显著提高了纳米粒子在MCF-7肿瘤细胞中的富集,充分突出了受体介导的靶向优势。空白纳米粒子的细胞毒性:双靶向纳米粒子MSNs-NH2-FA-RGD生物相容性良好,在0～160 μg·mL-1对MCF-7细胞和MCF-10A细胞活性无显著影响。载药纳米粒子的细胞毒性:游离PTX和PTX@MSNs-NH2-FA-RGD表现出良好的抗肿瘤活性,给药48 h后,游离PTX和PTX@MSNs-NH2-FA-RGD的IC50分别为(35.25±2.57)ng·mL-1 和(22.21±3.4)ng·mL-1,PTX@MSNs-NH2-FA-RGD表现出更强的肿瘤抑制作用。结论:本实验合成了载紫杉醇的双靶向介孔二氧化硅纳米粒子PTX@MSNs-NH2-FA-RGD,该纳米粒子载药量大,靶向性强,抗肿瘤活性好,在肿瘤治疗方面有一定的应用前景。