抗生素的发现是人类对抗病原菌感染的重大里程碑,但是传统抗生素是通过阻断细菌中共有的信号通路或新陈代谢途径来起作用的,往往无法区分杀菌对象,长期使用会导致菌群失调及耐药性的产生,因此我们需要找出一种新型抗菌药物能特异针对病原菌或耐药菌。CRISPR-Cas9系统来源于细菌的获得性免疫,能够利用RNA与Cas相关蛋白识别特异DNA序列并对其进行切割。与传统基因编辑工具如锌指核酸内切酶(ZFNs)和类转录激活因子(TALENs)相比具有简单,高效的优点。因此作为一种新型的基因编辑工具被广泛的应用于各个领域对基因进行改造如敲除,插入和点突变。另一方面,研究人员利用其对基因的特异性识别,从基因水平上识别病原菌或耐药菌,对其进行特异性的清除。因此,我们利用来源于上海生科院的pCas和pTarget质粒来表达CRISPR-Cas9系统,成功的在大肠杆菌(E.coli)基因组上将编码铁储存蛋白的ftnA和ftnB基因进行单基因和双基因同时敲除,以及kdpD基因的点突变,在所检测的菌落中,都达到了近100%的成功率。在针对特异性清除耐药菌方面,我们构建含碳青霉烯酶的耐药质粒转入菌中,形成耐药菌。利用CRISPR-Cas9系统针对β-内酰胺酶类中的碳青霉烯酶基因设计相应的N20-sgRNA,对含耐药基因菌进行特异的清除。接下来对已有的双质粒系统进行改造,构建新的IPTG诱导sgRNA表达的单质粒系统。观察IPTG诱导下CRISPR系统对耐药基因消除的动力学变化。为了进一步增加CRISPR系统对耐药质粒的消除效率,我们还做了不同的尝试如对耐药质粒上进行双位点识别切割以及使用重组修复缺陷型菌株等方法。最后为了进一步扩大CRISPR系统对耐药菌消除的范围,我们还尝试了针对临床分离的多粘菌素耐药质粒。实验结果表明,利用CRISPR系统可以特异的清除含有靶标的耐药基因,恢复细菌对抗生素的敏感性,最大效率可以达到10~6倍。最后,为了进一步缩短使用CRISPR系统时的步骤和时间,我们尝试了利用T7启动子转录体系构建Cloning-free CRISPR系统,来简化质粒构建部分,结果显示:T7启动子的转录体系能使CRISPR系统发挥正常功能,但是由于sgRNA片段在胞内存在的不稳定,导致效果并不理想,因此需要继续尝试通过不同的方式增加DNA片段在胞内的稳定性,以便达到Cloning-free的效果。