天然化学连接法(NCL)广泛应用于各种蛋白或多肽的合成,其反应机理为C-端硫酯和N-端半胱氨酸残基发生分子间硫酯交换,然后经过分子内的酰基转移,得到产物。天然化学连接法最主要的局限性在于,反应底物中必需要有半胱氨酸残基,而半胱氨酸残基在蛋白质中的含量又非常的少,平均含量仅为1.3%。因此,能否利用C-端硫酯直接和没有半胱氨酸残基的N-端氨基在生物反应体系、较温和条件下反应来合成多肽或蛋白成为化学合成研究的热点,也是生物化学家们关注的焦点。本研究以课题组的前期研究工作为基础,利用HMDO作为助剂,以环境友好的离子液体作为溶剂,完成新反应条件的筛选。我们首先以N-Cbz-L苯丙氨酸硫酯和L-苯丙氨酸乙酯反应为模板,找到最佳的反应条件,具体反应条件为：N-Cbz-L苯丙氨酸对甲苯硫酯用量为1当量,HMDO用量为1当量,L-苯丙氨酸用量为2当量,[BMIM]PF6为2mL,反应温度为40℃,反应时间为48小时,柱分离收率为93%。然后,我们研究了反应底物适应性,合成了一系列的二肽、三肽和四肽,结果表明,反应体系具有高度官能团相容性,反应体系中有羟基、羧基存在时,反应仍能很好进行。最后,通过HPLC监测反应,发现反应过程中产物没有发生消旋。我们也用此方法成功对一些小分子化合物和溶菌酶进行了修饰。高分辨质谱结果表明,溶菌酶在24小时后已经完全转化为产物。此外,我们也对氧酯与氨基反应合成多肽进行了初步探索,结果表明,在反应体系中加入0.1当量对甲苯硫酚,可以加快反应进程并提高反应收率,高分辨质谱结果也验证了反应过程经历了氧酯和硫酯之间的酯交换。自上世纪六十年代以来,蒽环类抗肿瘤药物阿霉素(DOX)就成为临床上用量最大的化学治疗药物之一,广泛用于治疗各种癌症,但是,长期使用阿霉素会出现多药耐药性,剂量累积性的心肌症和充血性心力衰竭也成为制约阿霉素临床用量的主要原因之一。本课题对前期DOX-EBP的合成路线进行了改进,用新开发的HMDO促进多肽合成方法,取代原合成路线中BOP催化的酰胺键合成方法,避免生成具有致癌性的六甲基磷酰三胺(HMPA),同时,也对DOX-EBP是否能够克服耐药性进行了研究。首先,我们从SW480细胞衍生得到耐药性的SW480/DOX细胞,并证明SW480/DOX细胞确实对游离阿霉素具有耐药性。然后,通过western blot分析发现,SW480/DOX细胞产生耐药性的原因是由于P-gp的过量表达。接下来,我们以阿霉素为对照药物,SW480细胞为对照细胞,研究DOX-EBP对SW480/DOX细胞的细胞毒性和DOX-EBP克服细胞耐药性的机制,结果表明,在两种细胞的膜囊泡内都没有检测到钒酸盐敏感的ATPase活性, DOX-EBP与P-gp没有相互作用,所以,DOX-EBP可以克服细胞的耐药性。最后,我们用抗表皮生长因子受体单克隆抗体C225阻断DOX-EBP与表皮生长因子受体的相互作用,内吞抑制剂PAO阻断表皮生长因子受体的内吞作用,来研究DOX-EBP进入细胞的途径,实验结果表明,DOX-EBP首先与表皮生长因子受体结合,然后通过通过表皮生长因子介导的内吞作用进入细胞,在溶酶体中分解,释放出游离阿霉素,发挥作用。综上所述,我们已经成功开发出HMDO促进的多肽合成方法,并将此方法应用于阿霉素(DOX)和表皮生长因子片段EBP的偶联物DOX-EBP的合成中,从而避免使用能生成致癌物HMPA的BOP。同时,机制研究表明,DOX-EBP可以克服肿瘤细胞的耐药性问题。