研究背景:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种严重危害人类健康的进行性发展的神经系统退行性疾病,表现为认知功能不断恶化,日常生活能力进行性减退和丧失。据WHO和国际阿尔茨海默病协会估计,目前全球约有4700万人患有痴呆,预计2050年将达到13200万,已成为威胁人类健康的全球性的重大卫生问题。近年来针对AD的药物试验均以失败告终,其根本原因在于AD的发病机制仍不完全明确,尚缺乏有效阻断或延缓AD发生发展的治疗靶点,这是当前AD研究亟待解决的突出问题。2003年,Kremerskothen等研究者首次描述了肾脑表达蛋白(kidney and brain expressed protein,KIBRA)基因的特征,作为WWC蛋白家族的一员,仅特异性表达在肾脏(例如肾小球足细胞、肾小管及集合管)和记忆相关的脑区(例如海马和皮质)神经元细胞内。全基因组相关性研究发现KIBRA多态性位点与人类记忆及认知功能存在相关性,因此KIBRA又被称为记忆相关基因。由于记忆障碍是AD最主要的临床表现之一,KIBRA成为AD的又一个重要的候选基因。KIBRA通过结合伴侣共同发挥作用,不仅连接细胞骨架和信号分子,还参与多种细胞功能调节,包括细胞极性和迁移,囊泡转运,转录水平的调节,特别是对突触可塑性和记忆形成起到重要作用。在KIBRA基因敲除小鼠中,KIBRA的缺乏加速了 α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid,AMPA)受体内吞,使突触后膜上的AMPA受体数目减少,引起海马区N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体依赖的长时程增强(long term potentiation,LTP)和长时程抑制(long-termdepression,LTD)的降低,导致KIBRA基因敲除小鼠的学习记忆障碍。AD的核心病理改变为β-淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)沉积形成的老年斑及高度磷酸化的Tau蛋白形成的神经原纤维缠结。Aβ在脑内的异常沉积,可诱发突触变性、氧化应激、炎症反应、神经元变性和凋亡等,最终导致AD的发生发展。最近在果蝇上的研究发现,KIBRA可作为调控囊泡转运的自噬调节因子,参与维持细胞自噬的正常功能,其缺乏会引起自噬囊泡形成和自噬降解的缺陷。一旦自噬囊泡产生或释放障碍,将会导致大量错误折叠蛋白异常蓄积,诱发细胞凋亡。因此,KIBRA的缺乏与细胞凋亡存在密切联系。目前研究已经证实了 KIBRA与AD密切相关,Aβ引起的神经元凋亡在AD的发病机制中起重要作用,由此推测KIBRA可能参与Aβ诱导的神经元凋亡,因此我们的研究主要围绕着KIBRA在AD中的相关分子机制展开。研究目的:1.明确在AD转基因动物模型中是否存在KIBRA的表达改变;2.明确KIBRA在神经元凋亡中的重要作用;3.研究KIBRA参与Aβ诱导的神经元凋亡的相关机制。研究方法:1.动物模型:我们利用APPswe/PSEN1dE9(APP/PS1)转基因小鼠及KIBRA基因敲除小鼠作为研究对象。APP/PS1转基因小鼠是目前AD研究领域应用较广泛的动物模型,购自美国Jackson实验室;KIBRA基因敲除小鼠是研究KIBRA生物学功能较理想的动物模型,由内布拉斯加大学医学中心董继鑫教授赠送。以同窝野生型小鼠作为对照,分别分笼喂养于光照/黑暗为12小时/12小时的恒温环境,自由摄食和饮水。2.行为学检测:不同月龄的APP/PS1转基因小鼠接受Morris水迷宫检测,观察其认知功能的改变情况。先行平台实验,若在60秒内未找到平台,引导至平台,台上停留30秒。连续5天后,撤去平台,行探索实验,第一象限入水。Smart 3.0软件录像跟踪系统记录,分析。指标包括逃逸时间(潜伏期)、探索路程、目标象限探索时间及路程、平台穿越次数等。3.细胞培养及转染:小鼠海马神经元细胞系HT22购自美国加利福尼亚大学。使用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素及0.1mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基,置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱中对细胞进行常规培养。根据细胞生长情况适时进行细胞传代、冻存或处理。细胞转染:生长状态良好的HT22细胞,病毒感染前一天铺六孔板,感染当天培养基中加入慢病毒悬液进行转染实验。细胞培养12-24小时后更换为完全培养基,转染72小时后进行荧光显微镜下观察GFP表达情况。4.Aβ1-42寡聚体的制备与鉴定:本实验中Aβ1-42寡聚体的制备主要参照纽约Rochester医学中心William J.Bowers教授制备方法所进行的。简而言之,在生物安全柜中使用气密注射器将222μL六氟异丙醇(hexafluoroisopropanol,HFIP)加入室温平衡后的粉末状Aβ,充分混匀,得到浓度为1mmol/L均质的Aβ-HFIP溶液。HFIP完全挥发,得到Aβ1-42的肽膜。然后加入适量的无水二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),充分振荡混匀、超声浴后得到5mmol/L的Aβ-DMSO溶液。继而加入适量PBS将其稀释得到浓度为50μg/mL(11.1μM)的溶液,4℃冰箱继续孵育2周,得到浓度为11.1μM的Aβ1-42寡聚体。每次使用前4℃ 13,000rpm离心10分钟,去除杂质。5.免疫组织染色:组织经固定、脱水、包埋之后进行切片染色。免疫组织化学染色抗体使用浓度:Aβ,1:400;Tau,1:800;P-TauThr181,1:400;KIBRA,1:100;应用DAB体系显色。免疫荧光染色抗体使用浓度:Tuj1,1:1000;KIBRA,1:100;应用Alexa Fluor荧光二抗进行荧光染色。通过TUNEL染色检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。每种染色图片采集后应用Image J图像处理软件进行图像分析。6.免疫蛋白印迹:RIPA缓冲液提取组织及细胞中蛋白,SDS-PAGE(8%、10%或12%丙烯酰胺)跑胶,转膜,孵育相对应的一抗。检测APP/PS1小鼠脑内KIBRA、Tau、P-Tau Thr181的表达水平;检测APP/PS1小鼠肠道KIBRA、Tuj1的表达水平;检测不同干预条件下细胞内凋亡相关蛋白的表达:活化的caspase3,剪切的PRAP;检测信号通路相关蛋白的表达:Akt总蛋白、P-AktSer473、PKCζ总蛋白、P-PKCζThr410、ERK1/2总蛋白及P-ERK1/2 Thr202/Tyr204。蛋白表达水平应用β-actin标化。免疫组织印迹条带采用Image J软件进行灰度分析。7.统计学分析:应用GraphPadPrism5进行数据的统计分析。定量数据用均数±标准差(文±S)进行表示。两组间均数的比较采用t检验,多组间均数的比较采用ANOVA方差分析。当p值小于0.05时,差异有统计学意义。研究结果:1.不同年龄APP/PS1小鼠认知功能、脑内Aβ沉积及Tau蛋白水平Morris水迷宫结果显示,9月龄和12月龄APP/PS1小鼠空间学习记忆能力比同窝对照小鼠均有下降,12月龄更为显著(p<0.05,p<0.01)。应用Aβ免疫组织染色方法,发现5月龄APP/PS1小鼠脑内开始出现Aβ沉积,至12月龄,大量的Aβ斑块沉积在皮层及海马区,而同月龄的野生型小鼠脑内始终没有观察到Aβ斑块沉积。免疫蛋白印迹分析,12月龄APP/PS1小鼠脑内p-TauThr181与总Tau表达量均明显高于对照组,两组之间存在显著统计学差异(p<0.01,p<0.05)。2.KIBRA在APP/PS1转基因小鼠脑内特异性表达通过KIBRA免疫组织染色分析,无论整个海马,还是海马亚区CA1区和CA3区,9月龄和12月龄APP/PS1小鼠KIBRA阳性细胞数量均明显低于对照组,其中12月龄尤为显著(p<0.01,p<0.001)。免疫蛋白印迹结果同样证实12月龄APP/PS1小鼠海马区KIBRA的表达明显低于野生型小鼠(p<0.001),两组小鼠皮层KIBRA的表达有升高趋势,但无统计学差异(p=0.0937)。我们进行了免疫荧光染色和共聚焦显微镜拍摄,发现KIBRA染色主要定位于神经元,而且与对照组小鼠相比,在12月龄APP/PS1小鼠海马区神经元中,KIBRA阳性染色减少(p<0.05),而皮层神经元中KIBRA阳性染色增高(p<0.01)。随着月龄的增加,KIBRA在APP/PS1转基因小鼠海马区的表达逐渐减少,提示海马区KIBRA的特异性降低与AD的学习记忆障碍密切相关。3.KIBRA在APP/PS1转基因小鼠肠神经系统特异性表达研究发现,Aβ斑块和神经原纤维缠结不仅在AD患者脑内异常沉积,也出现在AD患者的肠管内,可引起线粒体功能障碍、氧化应激、神经元丢失等,从而导致肠道神经功能障碍。免疫荧光染色结果显示,12月龄APP/PS1转基因小鼠的肠道内有大量的Aβ沉积(p<0.001)。我们进行了整体组织免疫荧光染色和共聚焦显微镜拍摄,发现与对照组小鼠相比,在12月龄APP/PS1小鼠的肠道神经元中,KIBRA阳性染色明显增多(p<0.05)。免疫蛋白印迹检测同样验证了,在12月龄APP/PS1小鼠肠神经系统中KIBRA表达量明显高于对照组(p<0.05),而两组小鼠神经元标志物Tuj1表达量无显著差异(p=0.9023)。与海马区特异性降低不同,KIBRA在APP/PS1小鼠肠神经元中表达明显增高。4.KIBRA在神经元凋亡中的重要作用通过TUNEL荧光染色和共聚焦显微镜拍摄,我们发现,与野生型小鼠相比,12月龄APP/PS1小鼠皮层和海马区神经元凋亡比例明显增多(p<0.01,p<0.01)。4月龄KIBRA基因敲除小鼠海马区神经元凋亡比例比野生型小鼠明显增加(p<0.05),提示KIBRA在神经元凋亡的发生中扮演不可或缺的角色。5.KIBRA对HT22细胞存活及Aβ诱导的神经元凋亡的保护作用我们使用CRISPR/CAS9慢病毒及过表达慢病毒分别转染HT22细胞,建立KIBRA基因敲低和KIBRA基因过表达细胞模型。结果发现,与空病毒组相比,在接种96小时后,KIBRA敲低组细胞增殖受到抑制(p<0.001),KIBRA过表达组细胞增殖明显加快(p<0.01),提示KIBRA是细胞增殖的积极调控因子。我们使用Aβ1-42寡聚体处理HT22细胞,建立Aβ神经毒性细胞模型。CCK8及免疫蛋白印迹结果显示,与空病毒组相比,经1μM的Aβ1-42寡聚体处理后的KIBRA敲低组细胞活力明显降低(p<0.01);凋亡相关蛋白(剪切的PARP、活化的caspase3)的表达量明显增高(p<0.05,p<0.01)。KIBRA过表达组细胞存活率明显优于空病毒组(p<0.05),凋亡相关蛋白(剪切的PARP、活化的caspase3)较空病毒组显著减少(p<0.05),进一步提示KIBRA参与抑制Aβ诱导的神经元凋亡,促进细胞增殖和存活。6.KIBRA通过激活Akt信号通路抑制Aβ诱导的神经元凋亡本实验筛选凋亡相关信号通路,结果显示,在1μMAβ1-42寡聚体处理1分钟后,空病毒组Akt Ser473位点磷酸化先被激活,KIBRA敲低组Akt Ser473位点磷酸化水平比空病毒组显著降低(p<0.05);在1μM Aβ1-42寡聚体处理2分钟后,KIBRA敲低组Akt Ser473位点磷酸化才被明显激活。在Aβ1-42寡聚体处理1分钟后,KIBRA过表达组Akt Ser473位点磷酸化明显被激活,AktSer473位点磷酸化水平比空病毒组显著增高(p<0.01)。此外,免疫蛋白印迹结果显示,与Aβ1-42寡聚体干预组相比,MK2206+Aβ1-42寡聚体干预组KIBRA过表达细胞Akt Ser473位点的磷酸化水平显著降低(p<0.05);剪切的PARP表达量明显增高(p<0.05)。与Aβ1-42寡聚体干预组相比,MK2206+Aβ1-42寡聚体干预组KIBRA过表达细胞存活率明显降低(p<0.05)。以上结果表明KIBRA通过激活Akt Ser473位点的磷酸化水平,抑制Aβ诱导的神经元凋亡。结论:1.随着月龄的增加,KIBRA在APP/PS1转基因小鼠海马区的表达明显减少。KIBRA在海马区的特异性降低与AD的学习记忆障碍密切相关,KIBRA作为记忆相关基因在AD的发生发展中起着重要作用。2.KIBRA在海马神经元凋亡中起到不可或缺的作用。3.KIBRA作为一种神经保护因子,通过激活Akt信号通路抑制Aβ诱导的神经元凋亡,促进细胞增殖及存活,为AD发病机制及治疗药物的研究提供了新的靶点。