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目的:探索尼古丁对IL-1β诱导的大鼠OA软骨细胞(模拟OA软骨细胞)的调节作用,观察是否能够通过激活软骨细胞内PI3K/Akt信号通路而抑制OA软骨细胞调亡、维持其存活;同时结合大鼠OA动物模型检测尼古丁对OA软骨组织损伤的影响,为将来临床上应用尼古丁预防与治疗OA的可能机制提供理论依据。
方法:体外实验:(1)软骨细胞分离培养:从新生大鼠关节软骨中分离出软骨细胞,使用特殊染色及免疫组化对其进行鉴定,并使其与软骨细胞凋亡诱导调节剂IL-1β(10ng/ml)共培养2小时,模拟体外OA软骨细胞。(2)软骨细胞生存能力检测:经尼古丁处理后,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测软骨细胞活性。(3)软骨细胞凋亡率检测:采用流式细胞仪荧光素碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)单标法检测软骨细胞晚期凋亡率。(4)PI3K/Akt通路及相关信号分子的检测:蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测Akt,p-Akt及其下游信号分子bcl-xl、bcl-2和p70S6,核糖体S6激酶的蛋白分泌水平;反转录RCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)检测Akt1-mRNA的表达水平。体内试验:(1)大鼠膝关节动物模型建立:通过右膝关节前交叉韧带切除+内侧半月板切除术构建大鼠骨性关节炎(OA)模型。(2)尼古丁对大鼠骨性关节炎关节软骨作用观察:关节腔注射尼古丁,组织学与免疫组化技术评估大鼠骨性关节炎关节软骨形态结构变化及与PI3K/Akt信号通路相互关系。
结果:(1)体外实验:经分离的细胞甲苯胺蓝着色胞浆染成浅蓝色,可见1-3个核仁,呈紫蓝色;细胞周围亦有少量异染颗粒出现,Ⅱ型胶原呈强阳性表达,细胞浆内有黄染颗粒,胞核基本无着色;尼古丁可刺激由IL-1β诱导的大鼠骨性关节炎软骨细胞的活性而抑制其凋亡。对大鼠骨性关节炎软骨细胞处以尼古丁可上调p-Akt蛋白表达水平,但却未能提高Akt1-mRNA的表达水平。进一步的实验检测到尼古丁可增强部分Akt下游分子:p70S6、核糖体S6激酶、bcl-xl、bcl-2、TMP-1的表达,但是却抑制了MMP-13的表达。(2)体内试验:大鼠骨性关节炎关节腔注射尼古丁促进损伤软骨表面的修复,增加了表面软骨的厚度,同时提高了p-Akt的蛋白表达。
结论:尼古丁可部分通过激活PI3K/Akt信号通路保护由IL-1β诱导的大鼠骨性关节炎模型软骨细胞的细胞凋亡;同时减缓骨性关节炎导致的关节软骨组织的损伤。为此,尼古丁通过关节腔注射将有望成为骨性关节炎的一种预防与治疗试剂。