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玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN,F-2)又称F-2毒素,是一种由镰刀菌和赤霉菌产生的具有强雌激素效应的次生代谢产物,主要来自于霉变的玉米等农作物和饲料。ZEN及其代谢物的与人和动物体内内源性的雌激素结构相似,因而可以与雌激素受体竞争结合,从而产生生殖生育毒性。ZEN分布的广泛性和高危害性给农业畜牧业带来了极大的经济损失,也对人类健康构成了严重的威胁。为减少ZEN带来的危害,国内外学者研究了各种脱毒方法,如以吸附剂和防霉剂为代表的物理法,酸碱处理和臭氧处理为主的化学法以及ZEN降解菌株及其关键酶的研究为热点的生物降解法。目前物理法研究最前沿的ZEN吸附剂对其吸附效率都不够高,化学处理手段会对原材料、环境甚至处理人员的身体健康有危害,因此,生物降解法逐渐成为ZEN降解的主要研究方向。本课题组已成功从霉变土壤中筛选得到一株能高效降解ZEN的不动杆菌Acinetobacter sp.SM04,从SM04的培养基上清中分离得到两种具有降解功效的酶,其中氧化酶A4-Oxa已在毕赤酵母表达系统中诱导得到155.43μg/mL蛋白,并可以在40℃下处理12小时后将ZEN去除53.41%。本论文主要研究另一种过氧化物酶Prx,通过设计简并引物P1、P2从SM04中扩增A4-Prx的编码基因并引入His标签,通过基因工程方法将目的基因插入表达载体pPIC9K中,转入Escherichia coli DH5α,成功构建重组质粒pPIC9K-Prx;将线性化载体pPIC9K-Prx转入Pichia Pastoris表达宿主GS115,构建重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-Prx-His,经诱导可得蛋白167.31μg/mL,其发酵上清液可以在60℃下处理12小时后降解99.43%的ZEN。为验证插入的His标签是否对Prx酶的活性造成影响,本论文通过设置不同ph和温度梯度,测试Prx-His和A4-Prx蛋白上清液对ZEN的降解率及过氧化物酶活性的影响。结果显示,插入His标签并没有对Prx蛋白产生明显不良的影响,且其耐热性稍微提高了一些。其中Prx-His的最适温度约为60℃,最适pH约为8。本文通过硫酸铵沉淀,Ni-Sepharose 6 FF柱洗脱后得到具有较高过氧化物酶活性的峰3,监测纯化过程中的过氧化物酶活力变化,得出最终的纯化倍数为9倍,纯化效果良好。为验证ZEN的降解产物,本文通过半制备液相色谱的方法制备得到该液相条件下6.5分钟出峰的产物,通过与对照组比对的HRMS结果显示,该产物质荷比为380。此外,本论文还用MTT实验的方法对MCF-7细胞进行细胞增殖率试验,结果表明,酶处理后的样品细胞增殖率明显降低,从275%降至150%,且细胞增殖率随着处理时间的增长而呈下降趋势,从230%降至101%。证明ZEN降解后生成低雌激素毒性产物。本论文还用ZEN的衍生物α-ZOL和β-ZOL作为底物,进行了降解率的测定。测得60℃处理8小时后β-ZOL几乎被完全降解而α-ZOL和ZEN则分别是62.19%和74.87%的降解率。