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19世纪以来的家畜良种化进程使全球性的家畜品种逐渐趋于单一化,大量的遗传资源尤其是地方品种遭到破坏。直至21世纪初,全球已知的7616个家畜品种中已有45%的品种濒临灭绝。在哺乳动物家畜中,体细胞核移植、体外受精和胚胎移植技术均已成功,能够结合精子、卵子、胚胎甚至是体细胞的冻存,实现种质资源的保护和物种复原。由于卵生的特点,上述方法均难以在家禽上实现。家禽的原始生殖细胞(Primordial germ cell,PGC)具有独特的通过血液迁移定居于性腺的特点,使得PGC迁移路径成为实现禽类物种复原的唯一途径。但是单个胚胎所获取的PGC远不足以满足实际应用所需。尤其是濒危品种的PGC来源成为了限制这一技术的难题。而体细胞能够在短期内大量获取,若能将其诱导成PGC无疑是解决这一困难的最佳路径。为了解决鸡体细胞诱导为PGC的难题,本研究对狼山鸡的鸡胚成纤维细胞(Chicken embryonic fibroblast,CEF)通过单细胞克隆技术进行了建系,获得了狼山鸡胚成纤维细胞单克隆细胞系(Chicken embryonic fibroblast single cloned cell line-Langshan,CSC-LS)。在 CEF和CSC-LS中通过慢病毒过表达重编程因子Oct4,Sox2,Nanog和Lin28结合BMP4/BMP8b/EGF诱导体系,将CEF重编程诱导出具有迁移能力的iPGC。以黑羽狼山鸡为供体,隐性白羽鸡为受体,建立了由CEF诱导产生能够迁移PGC的方法。同时,通过制备黑羽狼山鸡与隐性白羽鸡的原代PGC迁移模型产生供体PGC的后代,验证了 PGC路径的可行性,为iPGC的应用奠定了研究基础。研究结果如下:(1)CSC-LS CEF单克隆细胞的建立对狼山鸡CEF进行连续传代培养使之出现凋亡并进入增殖危机,继续培养获得极少数永生化细胞株。永生化细胞株经过单细胞挑取传代培养能够建立CSC-LS单克隆细胞系。对单细胞克隆的培养体系进行优化发现,Ham’s F12是制备单细胞克隆的最适培养基,克隆效率为25%±0.01,显著高于DMEM(11%±0.01)和D/F12(12%±0)培养基,口吸管法的单克隆制备效率为32.29%±0.04显著高于有限稀释法的6.95%±0.01。CSC-LS细胞系与正常的CEF相比具有正常的二倍体核型但增殖能力极显著增强(P
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