P311是于1993年首次在晚期胚胎小鼠的脑组织中发现,P311基因表达产生约8k Da大小的胞浆蛋白,因其N末端存在PEST结构域,较易被Met-HGF-SF、泛素-蛋白酶及金属蛋白酶等多条通路降解致其生物半衰期较短。成年人正常组织中并无P311表达,P311主要存在于神经细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞、软骨细胞中,已有研究表明,P311在促进神经组织修复、创面愈合、肿瘤血管形成、胚胎发育,维持血压平衡等方面发挥着重要作用。然而P311蛋白质分子量较小且表达极不稳定,这限制了对P311结构及功能的深入研究。因而迄今尚不完全明确P311的确切生物学功能及其转录激活调节机制,也未能将其归入到某一特定类型的蛋白质家族当中。不同于切割伤等其他普通创面,烧伤早期创面及创周局部均存在较为严重的缺血/缺氧。研究表明,缺血/缺氧是启动多种原因所致皮肤损伤、创面修复等病理生理学过程最主要的因素之一[1-7]。烧伤后,表皮干细胞(epidermal stem cell,Ep SC)脱黏附离开其固有巢穴、迁移、增值分化、再上皮化是创面修复的重要物质基础,因此有必要探讨缺氧环境对Ep SC生物学行为的影响。我们课题组前期分别在小鼠浅Ⅱ°烧伤模型及体外单层细胞创伤模型研究中发现,早期烧伤创周Ep SC P311表达明显增强,同时P311-/-Ep SC迁移速率较野生型明显下降,这说明,P311表达增强有助于Ep SC的迁移。有大量研究表明,缺氧条件下,绝大多数基因的表达都受HIF-1α(缺氧诱导因子-1α,hypoxia inducible factor-1α)的调节,它是缺氧条件下缺氧依赖性核心转录因子。HIF-1α的C末段存在着相对保守的氧依赖性降解结构域和两个反式转录激活结构域,因而常氧条件下容易受泛素-蛋白酶体等的降解而生物半衰期非常短;HIF-1α在缺氧条件下则不易降解而在细胞中蓄积。HIF-1α通过CBP/p300共刺激分子转入核内并与β亚基结合调节下游基因的转录激活。缺氧环境下HIF-1α高表达于软骨细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞中,这对于激活下游基因进而促进肿瘤转移、血管发生、胚胎发生、无氧糖酵解等生物学过程至关重要。那么缺氧环境下P311在Ep SC中表达及生物学活动是否也与HIF-1α调节有关呢?本研究旨在通过在体外条件下模拟缺氧环境,初步研究缺氧(1%O2浓度)及常氧环境下野生型及同属来源P311-/-新生小鼠Ep SC在不同时相点的划痕迁移速率,以及缺氧环境下野生型Ep SC中HIF-1α与P311之间的相互作用。划痕实验结果表明,缺氧早期,同种细胞缺氧条件下迁移速率较常氧条件下更快;同时,相同时相点P311-/-来源Ep SC较野生型小鼠Ep SC迁移速率更慢;实时荧光定量RT-PCR检测结果提示,缺氧条件下,表皮干细胞中HIF-1α及P311 m RNA水平均明显升高。同时,HIF-1α抑制后,P311 m RNA表达水平明显下降。免疫印迹实验及免疫细胞化学实验结果显示缺氧早期HIF-1α及P311蛋白表水平明显上升。相反,在细胞培养体系中加入HIF-1α抑制剂及稳定剂处理后,P311表达则相应降低或者升高。最后,通过P311启动子荧光素酶报告基因实验发现,缺氧条件下P311表达增加可能与HIF-1α的转录激活有关。综上,缺氧条件下,Ep SC中P311表达增强可能受HIF-1α的转录激活调节,P311表达能够促进Ep SC的迁移。这为下一步进行P311生物学功能及作用机理研究提供了新的思路。一、研究内容和方法1、HIF-1α与P311在缺氧促进表皮干细胞迁移中的作用1)表皮干细胞的培养及鉴定乙醚吸入麻醉新生小鼠,颈椎脱臼处死,灭菌后仔细分离皮肤组织,两步酶法及Ⅳ型胶原蛋白快速黏附法提取表皮干细胞,定期换液并观察细胞生长情况。2)表皮干细胞的流式鉴定取首次传代Ep SC,待细胞生长至70%左右融合时,用抗小鼠CD71及CD49f双抗孵育,流式细胞仪检测两种标志物CD71(-)/CD49f(+)的细胞百分比。3)划痕实验检测缺氧对表皮干细胞迁移首次传代细胞待生长融合至70%左右时,丝裂霉素C 5μg/m L常温常氧处理2 h抑制其增殖,SPSS随机分组。实验分两部分进行:第一部分,检测野生型常氧组、P311-/-常氧组、野生型缺氧组、P311-/-缺氧组各组Ep SC在划痕即刻、12 h、24 h、48 h后划痕愈合剩余宽度;第二部分,检测野生型缺氧组、野生型缺氧DMSO组、野生型HIF-1α抑制剂组、野生型HIF-1α稳定剂组各组在划痕即刻、12 h、24 h、48 h后划痕愈合剩余宽度,每组每时相点设三个插件。结果以均数±标准差表示,析因设计方差分析与单因素方差分析比较组间差异,P<0.05差异有统计学意义。2、在Ep SC缺氧中HIF-1α对P311的影响1)免疫印迹检测Ep SC中HIF-1α的表达情况分别取处于对数生长期第1代野生型及P311-/-小鼠Ep SC,SPSS法随机分组,在缺氧0 h、12 h、24 h、48 h后应用磷酸化蛋白提取试剂盒提取总蛋白,用SDS-PAGE法进行免疫印迹实验检测Ep SC中HIF-1α蛋白表达水平,凝胶成像仪下成像,Quantity one凝胶定量软件分析灰度值,将灰度值与内参β-Tublin进行比较,结果以比值表示。各时相点之间的比较采用单因素方差分析,P<0.05被认为差异有统计学意义。2)实时荧光定量RT-PCR检测HIF-1α对P311 m RNA在Ep SC中表达的影响SPSS随机分组,野生型缺氧对照组、野生型缺氧DMSO组、野生型HIF-1α抑制剂组、野生型HIF-1α稳定剂组Ep SC缺氧处理0、12、24、48 h后用TRNzol法提取总RNA,用紫外分光光度仪检测RNA浓度及纯度,进行实时荧光定量RT-PCR法检测P311与HIF-1αm RNA的表达量,以GAPDH为内参,△循环阈值(Ct)法处理结果,2-△△Ct即为m RNA相对表达量,总体比较采用析因设计及单因素方差分析,两两比较采用LSD分析,P<0.05差异有统计学意义。3)免疫细胞化学实验检测HIF-1α对P311在Ep SC中表达的影响同样SPSS随机分组,光学显微镜检测野生型缺氧组、野生型缺氧DMSO组、野生型HIF-1α抑制剂组、野生型HIF-1α稳定剂组缺氧处理0、12、24、48 h后Ep SC中P311表达(棕色颗粒为阳性)情况。每张图片取5个视野观察,图片导入Image Pro Plus 6.0进行分析,结果用积分吸光光度值表示。总体比较采用析因设计及单因素方差分析,两两比较采用LSD分析,P<0.05差异有统计学意义。3、荧光素酶报告基因实验检测HIF-1α对P311转录激活作用首先对P311启动子序列利用KOD-plus高保真酶进行PCR体外扩增,构建P311启动子表达质粒。待HEK-293细胞生长融合至约90%,瞬时转染细胞,p GL3/basic-空载缺氧组、p GL3/basic-P311常氧组、p GL3/basic-P311缺氧组、p GL3/basic-P311-HIF-1α抑制剂组在处理即刻、12、24、48 h后提取总蛋白并检测荧光素酶活性。以p GL3/basic-P311常氧组即刻为对照,总体比较采用析因设计及单因素方差分析,两两比较采用LSD分析,P<0.05差异有统计学意义。二、实验结果1.P311及HIF-1α在缺氧促进表皮干细胞迁移中的作用1)表皮干细胞纯化及鉴定所提取表干皮细胞经纯化、流式鉴定后发现CD71(-)/CD49f(+)细胞占87%左右;倒置相差光学显微镜下观察发现细胞呈铺路石样生长,单个细胞呈规则多边形,细胞体积较小,核质比较大,立体感较强,符合Ep SC的特征。2)缺氧条件下P311及HIF-1α对表皮干细胞迁移的影响与野生型缺氧组比较,P311-/-Ep SC常氧及缺氧、野生型HIF-1α抑制剂组12、24h划痕剩余宽度明显较宽;野生型HIF-1α稳定剂组12、24 h划痕剩余宽度明显变小,P值均<0.05,差异有统计学意义。7组间48 h总体比较无差异,(F=19.02,P>0.05).2.在Ep SC缺氧中HIF-1α对P311表达的影响1)免疫印迹实验检测HIF-1α在Ep SC中的表达免疫印迹实验结果表明,与常氧条件下相比,缺氧12 h后野生型及P311-/-Ep SC中HIF-1α表达至较高水平,24 h开始下降,48 h与常氧无明显差异。野生型小鼠表皮干细胞缺氧0、12、24、48 h的HIF-1α蛋白表达分别为1.02±0.05、2.56±0.09、1.60±0.17、1.17±0.03,总体比较差异明显(F=48.30,P<0.05)。与缺氧0 h比较,缺氧12 h后HIF-1α蛋白表达明显增强(P<0.01),缺氧24 h开始下降但仍高于缺氧0 h(P<0.05),缺氧48 h后降至常氧水平(P>0.05).2)实时荧光定量RT-PCR检测HIF-1α对P311 m RNA表达水平的影响与单纯缺氧组比较,HIF-1抑制剂组细胞缺氧各时相点P311 m RNA表达均明显下降(P值均小于0.05),HIF-1稳定剂细胞则在缺氧12和24 h明显升高(P值均小于0.05)。与HIF-1抑制剂组比较,DMSO对照组和HIF-1稳定剂细胞在缺氧0、12、24 h P311m RNA表达均明显升高(P值均小于0.05)。与单纯缺氧组比较,HIF-1抑制剂组细胞缺氧各时相点P311表达均明显下降(P值均小于0.05),而HIF-1稳定剂组则在缺氧12和24 h明显升高(P值均小于0.05)。与HIF-1抑制剂组比较,DMSO对照组和HIF-1稳定剂组细胞P311表达缺氧12和24 h明显升高(P值均小于0.05).3)免疫细胞化学实验检测P311表达水平野生型缺氧对照组、野生型DMSO对照组、野生型HIF-1α抑制剂组、野生型HIF-1α稳定剂组各组缺氧12 h后P311阳性细胞数目分别为23.1±1.2、22.5±1.1、6.2±0.8、29.6±1.3;与野生型缺氧对照组相比,野生型抑制剂组12,24 h P311表达明显下降,而野生型HIF-1α稳定剂组则明显上升,P值均<0.05,各组差异有明显统计学意义.3.HIF-1α对P311的转录激活作用培养0 h,空载缺氧组、P311常氧组、P311缺氧组、P311缺氧+HIF-1抑制剂组细胞荧光素酶活性差异无统计学意义(F=13.33,P>0.05)。培养12 h与空载缺氧组比较,P311缺氧组细胞荧光素酶活性较高(P<0.01);与P311常氧组比较,P311缺氧组细胞荧光素酶活性明显升高(P<0.05);与P311缺氧组比较,P311缺氧+HIF-1抑制剂组细胞荧光素酶活性明显下降(P<0.01)。结论缺氧早期,HIF-1α可能通过诱导P311表达升高促进表皮干细胞迁移。