论文部分内容阅读
PPR基因家族在植物生长发育过程中至关重要,参与质体基因转录后加工、调控细胞质雄性不育基因的表达、调控胚胎发育等。番茄与烟草基因组计划的完成,为其PPR基因家族的全基因组鉴定奠定了基础。细胞质雄性不育恢复基因(Rf)除个别外均编码PPR蛋白,是PPR基因家族的成员。在农业生产中,多利用雄性不育系生产烟草杂交种。但是,目前尚未在普通烟草中发现不育系的恢复系,也未见有烟草雄性不育/恢复作用机理的相关研究报道。本研究分析了番茄和绒毛状烟草PPR基因家族,克隆了绒毛状烟草中的Rf相关基因,不仅对其进行了在不同品种不育系中的过表达分析,还对K326进行了RNAi研究,探讨其与烟草雄性不育发生的关系,为烟草雄性不育/恢复机理的研究提供参考。获得的主要结果如下:(1)在番茄基因组鉴定了471个PPR编码基因。根据保守结构域将其分为P和PLS亚家族,各占序列数目的一半;PLS亚家族又分为PLS、E、E+和DYW四类。该基因家族分布在番茄12条染色体上,其中约60%的基因无内含子结构,平均每个基因含有1.03个内含子;约70%的PPR基因具有RNA结合活性。(2)在绒毛状烟草基因组鉴定了487个PPR编码基因,其中P和PLS亚家族各264和223条,PLS亚家族包含PLS、E、E+和DYW四个亚类型各22、76、56和69条序列;各个结构域高度保守,与番茄相比,S结构域的变异率最小,为12.9%,E+结构域最大,为29.0%。该基因家族较均匀的分布在绒毛状烟草12条染色体上,其中61%的基因无内含子结构,平均每个基因含有内含子个数为1.2个;74%的PPR基因具有RNA结合活性。(3)从绒毛状烟草基因组克隆了6条Rf基因相关序列,命名为NtomRf1~6,GenBank编号分别为KF770956~KF770961。其中,NtomRf2和NtomRf6存在碱基删除突变;其它4条为完整读码框,但NtomRf5包含3个PPR结构域缺失,且其在不育系MS K326中存在C/A颠换和T缺失突变,导致3’非编码区通读。NtomRf1、3、4、5均编码含有10~13个PPR结构域的PPR蛋白,定位于线粒体。6条Rf序列在检测的组织中均有表达,但存在表达偏好;其在MS K326中的表达量高于其保持系K326。(4)选择基因NtomRf4和NtomRf5构建了过表达载体,并分别转化不同烟草品种的不育系,其转基因植株阳性率为66.3%。NtomRf4和NtomRf5基因在过表达阳性植株不同组织中的表达量提高了1.9~3.7倍,但是却均不能使MS K326等不育系的雄蕊正常发育,也即不能使其恢复育性。说明MS K326及其他烟草不育系品种不育性发生的机制非常复杂,不能为单一Rf基因恢复。(5)构建了NtomRf4和NtomRf5基因特异序列的干扰载体,转化K326得到转基因植株的阳性率为100%。NtomRf4和NtomRf5基因在RNAi K326阳性植株中的表达量下降了57.1%~85.3%,但仍有可检测的表达量,可能是其花器官和雄蕊发育正常,且能产生花粉的原因之一。下一步收获T1代种子后,进行发芽实验,观察其发芽率是否降低或者T1代植株是否不育。