研究背景和目的:放疗、职业暴露、意外事故、战争等多种原因都可以对皮肤造成放射性损伤。大剂量的辐射可致急性放射性溃疡,小剂量辐射引起放射性皮炎,迁延不愈可造成慢性放射性溃疡,若不及时治疗,甚至可导致放射性皮肤癌。放射性皮肤损伤在临床上通常表现为潜在性、进展性、难以愈合的特点,放射性皮肤溃疡向深部发展,可以损伤肌肉、血管、神经等深部组织,严重影响患者的生活质量,甚至威胁生命。目前在临床中放射性皮肤损伤以放射性皮肤溃疡最为常见,切除病变组织,用皮瓣修复缺损是最为常见和有效的治疗方法。近年来,脂肪干细胞(ADSCs)作为再生医学和组织工程领域内的研究热点,从脂肪组织中提取,具有取材方便,供源广泛的特点。ADSCs属于间充质干细胞(MSCs),具有多项分化潜能和免疫豁免的生物学特性,并能够分泌多种细胞因子。因此,ADSCs具有广泛的临床使用前景。将ADSCs作用于放射性皮肤损伤的创面,在诸多临床实验、动物实验中都证实了ADSCs促进组织修复的能力。由于ADSCs具有向多种组织分化的潜能,因此在修复创面的过程中,可以直接分化为受损的组织细胞参与修复进程。然而随着对ADSCs研究机制的不断深入,越来越多的研究者们认为旁分泌作用在修复创面的过程中起主导作用,ADSCs可以分泌大量细胞因子包括生长因子、抗炎因子等,还可以释放具有特殊功能的细胞外囊泡(EVs),发挥抗凋亡、抗炎、促进血管生成的作用。然而,对于ADSCs逆转放射性皮肤损伤的机制还需要进一步的研究。我们通过将大鼠脂肪干细胞(r ADSCs)与辐射后的大鼠皮肤成纤维细胞(r Fbs)隔以半透膜共同培养建立r ADSCs修复放射性皮肤损伤的细胞模型,观察共培养对r Fbs放射性损伤的修复,探索ADSCs通过旁分泌作用促进放射性皮肤损伤愈合的机制,为进一步研究ADSCs修复放射性皮肤损伤奠定基础。本课题主要研究内容如下:第一部分大鼠脂肪干细胞、成纤维细胞的分离与鉴定目的分离并提取高纯度的r ADSCs、r Fbs。方法选取雄性SD大鼠,重约200-250g,腹腔注射水合氯醛麻醉后,取腹部皮下脂肪组织,将组织剪至2-4mm小块,加入配好的混合酶溶液中,按要求设置组织处理器程序,分离出r ADSCs。取大鼠腹部皮肤组织,剪去皮下粘膜,将组织剪成4mm×5mm大小的组织块,放入分散酶溶液消化过夜,分离表皮和真皮,将真皮放入胶原酶溶液反应,分离出r Fbs。将两种细胞分别在镜下观察其形态;CCK-8法描绘两种细胞的生长曲线;流式细胞术检测CD29、CD44、CD31和CD45在r ADSCs细胞表面的表达;成脂、成骨诱导培养鉴定其多向分化潜能;HE染色、波形蛋白免疫组化鉴定r Fbs。结果在倒置显微镜下,大鼠原代r ADSCs呈长梭形或多边形,与成纤维细胞相似,细胞核大而明显,位置居中,核仁明显;大鼠皮肤r Fbs在显微镜下形态清楚,呈现长梭形,核较小,呈卵圆形居中,细胞集落呈现旋涡状或者菜花状。流式细胞术显示r ADSCs中CD29、CD44呈阳性表达,表达率分别为99.42%、98.29%,CD31、CD45呈阴性表达,诱导分化鉴定发现r ADSCs具有成骨、成脂分化分能力,证明其有多向分化潜能。光镜下,HE染色切片可见r Fbs胞浆淡染,深染的细胞核呈圆形或椭圆形居于正中,免疫组化显示r Fbs的Vimentin阳性表达率几乎为100%。CCK-8表明两种细胞的都具有很强的增殖能力。结论通过酶消法提取的r ADSCs和r Fbs具有较高的纯度和活性,为后面建立细胞模型作了充分准备。第二部分体外实验检测放射对r Fbs功能的影响目的通过建立辐射对r Fbs的损伤模型,研究在不同辐射剂量、辐射后不同时间点下r Fbs的状况,为下一步共培养模型的建立确定合适的辐射剂量和时间观测点。方法用直线加速器将r Fbs分别予以2 Gy、8 Gy、16 Gy、24 Gy、32Gy的剂量进行辐照,设置未受辐照的对照组。用CCK-8法描绘各组r Fbs的生长曲线;在辐照后第2、4、6天,通过流式细胞术检测各组r Fbs的细胞周期和细胞凋亡,进行对比。结果随着辐射剂量的增加,r Fbs的增殖能力逐渐下降,细胞凋亡比率增加,细胞周期中G1期比例下降,G2期比例上升,G1/G2比值下降,在辐射后第二天变化最为明显。结论辐射会导致r Fbs增殖能力下降,细胞凋亡增加,G2期阻滞,并且具有一定的剂量—效应关系。根据实验结果,我们选择辐射剂量为8Gy建立共培养模型,在辐射后第2天进行相关指标的检测。第三部分体内、体外实验检测r ADSCs通过旁分泌作用修复r Fbs放射性损伤目的将r ADSCs与辐射后的r Fbs隔以半透膜共同培养,其培养基能够促进大鼠放射性皮肤损伤的愈合,并且r ADSCs能够通过旁分泌作用修复半透膜外r Fbs的放射性损伤,说明共培养模型的有效性,进一步探讨ADSCs的修复机制。方法:在体内实验中建立大鼠放射性皮肤损伤模型,分别将r ADSCs、r ADSCs共培养基、完全培养基在创面周围局部注射,通过创面面积测量、HE和Masson染色观察创面组织结构变化,PCNA和Tunel实验检测细胞增殖和凋亡,免疫组化方法检测创面组织CD31、TNF-α的表达,Western blot检测生长因子VEGF的水平,综合反映大鼠放射性创面的愈合状况。在体外实验中,按照分组进行细胞处理:A组—r ADSCs与辐射后r Fbs共培养组;B组—NRK与辐射后r Fbs共培养组;C组—辐射后r Fbs单独培养组;D组—r ADSCs与r Fbs共同培养组;E组—r Fbs单独培养组。通过划痕实验比较各组r Fbs迁移能力的差异,流式细胞仪检测各组r Fbs的细胞凋亡和细胞周期,Ed U检测各组r Fbs的细胞增殖能力,Western blot检测r Fbs的CCND1、P53的水平,ELISA检测培养基中TGF-β、GCSF、COLⅠ、COLⅡ等指标。结果在大鼠放射性皮肤损伤模型中,r ADSCs共培养基应用于大鼠放射性创面中,可以降低炎症反应,促进血管生成和胶原产生,增强细胞增殖能力,促进创面愈合。在体外实验中,辐射可以引起r Fbs增殖、迁移能力下降,细胞凋亡增加,G2期阻滞,CCND1蛋白水平下降,P53蛋白水平升高,分泌细胞因子TGF-β水平升高,而GCSF、CollagenⅠ、CollagenⅡ水平下降。r ADSCs共培养模型中r Fbs增殖迁移能力明显上升,细胞凋亡减少,G2期阻滞减轻,CCND1蛋白水平升高,在培养基中,TGF-β水平下降,而GCSF、CollagenⅠ、CollagenⅡ水平升高。结论r ADSCs与辐射后r Fbs的共培养基在动物模型中能够有效促进大鼠放射性皮肤损伤创面愈合。共培养模型中r ADCSs可以通过旁分泌作用增强放射后r Fbs的增殖、迁移能力,降低细胞凋亡,修复r Fbs放射性损伤。