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前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)是男性最常见的恶性肿瘤之一,在不同的国家和地区,PCa的发病率和死亡率差别很大。随着我国老龄化人口比例逐渐增高,前列腺癌发病率有逐年上升的趋势。近来研究表明,细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)在PCa发生发展的过程中发挥了重要作用,其启动子区的单核苷酸多态性与PCa的发生发展之间存在着相关性。本研究检测了IL-6基因及蛋白在前列腺癌及其细胞系中的表达；构建携带基因IL-6-shRNA特异性腺病毒表达载体并将其感染人前列腺癌PC-3细胞系,观察IL-6-shRNA对PC-3细胞生长及凋亡的影响；对湖北地区汉族人群中前列腺癌患者IL-6基因启动子区的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)进行分型,以探讨IL-6基因SNP与湖北地区汉族人群前列腺癌的关系。分四个部分简述如下。第一部分IL-6蛋白及基因在前列腺癌中的表达及意义目的：探讨细胞因子白细胞介素-6(IL-6)在前列腺癌发生发展中的作用及其临床意义。方法：①采用免疫组化SABC法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法对前列腺癌组织及其相应的癌旁前列腺组织和前列腺癌细胞系PC-3及LNCaP中的IL-6表达进行检测；②采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测前列腺癌患者及随机正常人群外周血中IL-6的浓度和前列腺癌细胞系PC-3及LNCaP培养上清液中的IL-6浓度。结果：①前列腺癌组织中IL-6表达明显强于相应的癌旁前列腺组织,且与肿瘤的分期分级相关；PC-3细胞中IL-6呈强阳性表达,而LNCaP细胞中IL-6呈弱阳性表达。②前列腺癌患者外周血中IL-6浓度显著高于正常人群组；而PC-3细胞组培养上清液中IL-6浓度也明显高于LNCaP细胞组。结论：IL-6基因可能在前列腺癌的发生发展中起重要作用,有可能是前列腺癌从激素依赖性转化为激素非依赖性的因素之一。第二部分携带基因IL-6-shRNA特异性腺病毒表达载体的构建与鉴定目的：构建并鉴定含有基因IL-6-shRNA的腺病毒表达载体,感染前列腺癌细胞PC-3,并检测重组质粒对IL-6的沉默效应,为后期实验提供靶细胞。方法：分别设计三条以基因IL-6mRNA为靶序列的shRNA和阴性对照序列(HK),应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pGensil-1中,构建的3条重组shRNA真核表达质粒分别命名为pGensil-1_IL-6-shRNA1、_IL-6-shRNA2和_IL-6-shRNA3。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中,经筛选后对提取质粒进行酶切和测序鉴定。测序正确后,利用腺病毒载体系统Adeno-X构建重组腺病毒质粒rAd-IL-6-shRNA1-3,酶切、PCR鉴定重组腺病毒质粒,鉴定正确后,将rAd-IL-6-shRNA1-3转染至HEK293细胞,包装成复制缺陷型腺病毒质粒rAd-IL-6-shRNA1-3。大量扩增rAd-IL-6-shRNA1-3,测病毒滴度。将构建的重组质粒感染到PC-3细胞中,感染72小时后,应用RT-PCR及Western-blot鉴定IL-6mRNA和蛋白的表达变化。观察各组质粒对IL-6mRNA和蛋白的抑制效率,筛选最有效的干扰序列。结果：酶切分析、测序鉴定表明rAd-IL-6-shRNA1-3构建成功；转染PC-3细胞后,RT-PCR及Westen blot结果显示,pGensil-1-IL-6-shRNA3干扰效果最强。结论：携带有IL-6-shRNA基因的重组腺病毒质粒构建成功,并筛选出pGensil-1-IL-6-shRNA3为沉默效应最强的质粒,它能有效抑制IL-6基因表达；建立了rAd-IL-6-shRNA感染人前列腺癌细胞PC-3的长期稳定细胞系,为进一步探讨IL-6在前列腺癌生物学行为中的作用奠定了基础。第三部分IL-6-shRNA对前列腺癌细胞PC-3生物学行为的影响目的：观察shRNA沉默IL-6基因对前列腺癌细胞PC-3增殖和凋亡的影响,初步探讨IL-6基因在前列腺癌发生和进展过程中的作用。方法：实验分为三组：实验组(PC-3/IL-6-shRNA组,感染rAd-IL-6-shRNA)、空白对照组(PC-3组,未感染腺病毒质粒)和阴性对照组(PC-3／HK组,感染rAd-HK)。利用MTT法细胞计数并绘制细胞生长曲线；Hoechst33258染色、流式细胞仪检测细胞凋亡情况；细胞迁移实验观察感染后细胞侵袭能力的变化。结果：MTT法观察显示,感染rAd-IL-6-shRNA后细胞生长增殖速度较对照组明显减慢；Hoechst33258染色显示部分细胞呈现凋亡形态学改变；流式细胞仪定量检测表明感染IL-6-shRNA基因后,PC-3细胞出现较为明显的凋亡峰；细胞迁移力显著低于对照组。结论：通过RNA干扰沉默IL-6基因的表达能有效地抑制PC-3细胞的生长增殖和迁移,并诱导细胞的凋亡。IL-6基因可能在前列腺癌发生和进展过程中扮演重要角色,抑制IL-6基因的表达可能成为前列腺癌基因治疗的可行策略。第四部分白细胞介素-6基因单核苷酸多态性与前列腺癌的关系目的：探讨白细胞介素-6基因启动子区-174G／C、-634C／G位点的单核苷酸多态性与湖北地区汉族人群前列腺癌的关系。方法：采用TaqMan探针荧光定量PCR技术对IL-6基因启动子区-174G／C、-634C／G位点的单核苷酸多态性进行基因分型,观察前列腺癌组和正常对照组的基因型频率、等位基因频率及其患病风险。结果：①所有实验对象-174G／C位点的基因型均为GG型,无CG型及CC型存在；②前列腺癌组与正常对照组-634C／G位点的GG、CG和CC基因型频率及其G和C等位基因频率差异显著(P<0.05)；且GG+CG基因型频率随临床分期及病理分级的增加而增加。结论：IL-6基因启动子区-174G／C位点在湖北地区汉族人群中可能不存在单核苷酸多态性；而-634C／G位点的单核苷酸多态性与前列腺癌的发生发展具有一定程度的相关性,具有GG+CG基因型的人患前列腺癌的危险性相对较高。