目的:　　 肿瘤是严重威胁人类健康的重要疾病。胃癌是一种常见的恶性肿瘤,其死亡率在世界范围内高居第二,在我国则居于第一位。对肿瘤的发病机制及其诊断治疗的研究是目前肿瘤研究领域的重要课题。最近的研究表明,肿瘤细胞信号转导通路的异常是导致肿瘤早期发生和晚期侵袭转移的主要原因。2004年底NatureReviews Cancer和Nature Reviews Drug Discovery联合论述了激酶信号通路在肿瘤中的作用,将激酶信号通路确定为肿瘤治疗的靶点,成为未来抗肿瘤药物的一项研发策略。　　 p21活化激酶(p21-activated kinases,PAKs),为一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,目前被认为是肿瘤细胞内信号网络的关键调节因子。PAKs作为小G蛋白Rho家族的下游靶蛋白,可被生长因子及其他胞外信号活化,并通过众多的下游结合蛋白或激酶底物,调节控制许多生物学功能,如:细胞骨架重组、细胞凋亡、有丝分裂等,特别是在细胞的恶性转化和肿瘤细胞侵袭转移过程中具有重要作用,因此成为肿瘤治疗新的靶点。迄今为止PAK家族共发现6个成员,根据其结构及生化特性,将它们分为两类,Ⅰ类包括PAK1-3,Ⅱ类包括PAK4-6。PAK4是目前研究得最为深入的Ⅱ类PAK成员,在细胞的生长、生存、增殖及迁移侵袭中发挥重要作用,其过度表达、基因扩增、基因突变广泛存在于多种肿瘤中。由于PAK4与肿瘤的发生发展密切相关,已被确认为潜在的肿瘤治疗新靶点。目前国际上针对该靶点抑制剂的研究尚处于起步阶段。　　 本研究通过Kinase Glo激酶发光检测方法对计算机辅助设计的针对PAK4的多种小分子化合物进行高通量筛选,获得PAK4小分子抑制剂LCH-7749944。验证其对PAK4激酶活性的抑制作用,研究该小分子抑制剂对胃癌细胞生物学功能的影响,并深入探讨其作用机制,为PAK4靶向抑制剂的开发及胃癌治疗新策略的研究提供依据。　　 方法:　　 一、PAK4小分子抑制剂的筛选以及LCH-7749944对PAK4激酶活性抑制作用的验证　　 1、用Kinase Glo激酶发光检测方法对计算机辅助设计的针对PAK4的多种小分子化合物进行高通量筛选,获得具有活性的小分子化合物。　　 2、激酶分析实验检测LCH-7749944在体内外对PAK4激酶活性的影响。　　 3、激酶分析实验检测LCH-7749944在体外对PAK家族其他成员激酶活性的影响。　　 4、Kinase Glo激酶发光实验检测LCH-7749944经结构改造修饰得到的多种衍生物对PAK4激酶活性的影响。　　 二、LCH-7749944抑制胃癌细胞增殖、侵袭及机制的研究　　 1、MTT实验检测LCH-7749944对人胃癌细胞增殖的影响。　　 2、流式细胞术检测LCH-7749944对胃癌细胞细胞周期的影响。　　 3、Western Blot及Real time-PCR方法检测LCH-7749944对细胞周期相关蛋白cyclinD1蛋白及mRNA水平表达情况的影响。　　 4、Transwell实验检测LCH-7749944对胃癌细胞迁移及侵袭能力的影响。　　 5、共焦激光扫描显微镜观察LCH-7749944对细胞骨架的影响。　　 6、Western Blot检测LCH-7749944对HGF下游c-Met-PAK4-LIMK1-cofilin信号通路的影响。　　 7、Western Blot检测LCH-7749944对PAK4-MEK-ERK1/2-MMP2及PAK4-c-Src-EGFR-cyclin D1信号通路的影响。　　 8、计算机模拟小分子化合物LCH-7749944与PAK4、c-Met蛋白分子的对接情况,并比较化合物LCH-7749944及其衍生物WAY-3与PAK4蛋白的作用方式。　　 结果:　　 一、PAK4小分子抑制剂的筛选以及LCH-7749944对PAK4激酶活性抑制作用的验证　　 1、通过Kinase Glo激酶发光方法筛选得到LCH-7749944等多个能够影响PAK4激酶活性的小分子化合物,从中选择对PAK4抑制作用比较明显的LCH-7749944作为研究对象。　　 2、LCH-7749944在体内外均能够以剂量依赖的方式抑制PAK4的激酶活性。　　 3、LCH-7749944在体外对于PAK1、PAK5的激酶活性均有一定程度的抑制作用,但其抑制效能均明显低于对PAK4的抑制效能;而对于PAK6的激酶活性未见明显影响。　　 4、目前得到的LCH-7749944衍生物中未发现能够更高效抑制PAK4活性的化合物。　　 二、LCH-7749944抑制胃癌细胞增殖、侵袭及机制的研究　　 1、LCH-7749944抑制人胃癌细胞BGC823、MKN-1、SGC7901和MGC803的增殖。　　 2、LCH-7749944抑制人胃癌细胞SGC7901、BGC823细胞周期中G1期向S期的转化。　　 3、在SGC7901细胞中,LCH-7749944在RNA及蛋白水平均能够下调细胞周期相关蛋白cyclin D1的表达。　　 4、LCH-7749944能够抑制胃癌细胞SGC7901、BGC823及稳定表达PAK4的MKN45细胞的迁移及侵袭能力。　　 5、LCH-7749944能够可逆性抑制SGC7901细胞丝状伪足的形成。　　 6、在SGC7901细胞中,LCH-7749944能够抑制c-Met-PAK4-LIMK1-cofilin信号通路的活性。　　 7、在SGC7901细胞中,LCH-7749944通过抑制PAK4激酶活性抑制下游PAK4-MEK-ERK1/2-MMP2及PAK4-c-Src-EGFR-cyclin D1信号通路。　　 8、化合物LCH-7749944能够作用于PAK4及c-Met的活性位点从而发挥抑制其活性的作用。同时,LCH-7749944与PAK4结合的自由能高于WAY-3,且形成氢键的能力更强,与PAK4有更高的亲和力。　　 结论:　　 1、LCH-7749944在体内体外均能够抑制PAK4的激酶活性。　　 2、LCH-7749944通过下调PAK4-c-Src-EGFR-cyclin D1通路,抑制胃癌细胞G1期向S期的转化,从而抑制胃癌细胞增殖。　　 3、LCH-7749944通过抑制c-Met-PAK4-LIMK1-cofilin和PAK4-MEK-ERK1/2-MMP2两条通路,且抑制细胞丝状伪足形成,从而抑制胃癌细胞迁移侵袭能力。　　 4、化合物LCH-7749944与PAK4、c-Met均有较高亲和力,并可作用于两种激酶的活性位点发挥抑制作用。