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前言: 脑卒中目前是临床常见病、多发病,是目前三大致死疾病之一、是首位致残因素,且在我国其发病率、病死率及致残率有逐年上升的趋势,其中缺血性脑血管病占绝大部分。缺血性脑血管病尤其是脑缺血后的再灌注损伤,危害极大。脑缺血再灌注损伤是指脑缺血致脑细胞损伤,恢复血液再灌注后,其缺血性损伤反而进一步加重的现象。研究表明,线粒体功能障碍、细胞凋亡、氧自由基激活及炎症反应与脑缺血再灌注损伤的发生密切相关。然而,目前尚缺乏有效的治疗手段。因此,寻找新的脑缺血再灌注损伤的治疗方法,对于减轻脑缺血后的再灌注损伤,降低其致死率具有重要意义。 内皮祖细胞(EPCs)是一种来源于骨髓的前体细胞,能增殖分化为成熟的血管内皮细胞,也称为成血管细胞(angioblast),在内源性因素,外源性细胞因子,药物等因素的刺激下,EPCs可以从骨髓中动员进外周血参与出生后缺血组织的血管发生和血管损伤后的修复。近年来,基于内皮祖细胞的细胞治疗手段在治疗高血压、糖尿病、冠心病、脑卒中等方面的应用正日益受到关注。其中Ohta(2006)等人发现通过静脉注射经体外扩增的骨髓来源的EPCs可以显著减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。然而,EPCs对脑缺血再灌注损伤的相关生物学机制仍不十分清楚,有待于进一步研究。 目的: 为了观察移植骨髓来源的内皮祖细胞能否减少缺血再灌注损伤模型大鼠脑梗死容积,减少再灌注损伤所造成的神经功能损害,并研究其可能的脑保护机理,与抑制缺血再灌注后细胞凋亡、氧化应激以及对核因子-κB表达水平变化的关系,以探讨内皮祖细胞对脑梗死潜在治疗作用及其相关机制。 材料和方法: 1、EPCs的制备:SD大鼠经常规麻醉后取股骨及胫骨,淋巴细胞分离液冲洗骨髓,密度梯度离心分离单个核细胞,置于EGM-2MV培养液中培养,,显微镜下观察其细胞形态。培养第六天加CM-Dil。培养第一天和第十天时流式细胞术检测内皮祖细胞标志物CD31、CD34、CD133、KDR表达阳性的细胞比例。培养第十天加DAPI备用。 2、线栓法脑缺再灌注动物模型的建立:40只大鼠将SD大鼠麻醉,分为假手术组(sham),模型组(IR)和治疗组(ADSC),IR和ADSC组,实验大鼠采用线栓法大脑中动脉脑缺血再灌模型(MCAO)建立局灶性脑缺血再灌动物模型。缺血2h后再灌注,ADSC组再灌注0和12小时时通过静脉注射1.0-2.0×106个(0.5ml)经CM-Dil标记的内皮祖细胞,IR组注射等体积生理盐水。 3、形态学检查:将各组中的脑组织经TTC(2,3,5—氯化三苯基四氮唑)染色,计算脑梗塞面积。 4、迁移检查:取缺血部分脑组织,荧光显微镜下观察是否有pkh26标记的内皮祖细胞。 5、脑组织中NF-κB表达检测:免疫组织化学染色,real-time PCR,western blot检测各组脑组织中NF-κB的表达水平。 6、抗氧化检测:试剂盒方法检测SOD,GSH,GSH-PX和MDA的活性。 7、凋亡检测:试剂盒方法检测各组大鼠脑组织中caspase-3的活性。western blot检测缺血脑组织中bcl-2和bax的表达水平。 结果: 1、经10天培养后获得了细胞呈纺锤形的细胞,经流式细胞检测CD33+46.81%,CD34+70.83%,CD133+81.66%,flk-160.5%,达到作为实验治疗的要求。 2、EPCs的治疗组缺血再灌注模型大鼠的的神经功能损害较对照组显著减低(P<0.01),ADSC脑梗死容积(76.76±8.19mm3),小于IR组梗死容积(143.39±8.23mm3)(P<0.01),通过荧光共聚焦检查发现在脑缺血区域有经pkh26标记的EPCs存在,表明静脉注射的EPCs可趋化、迁移至梗死区域。 3、NF-κB免疫组化染色表现为在光镜下观察为细胞胞核染色,呈棕黄色。sham组有零星凋亡细胞,IR组镜下可见大量核染色的凋亡细胞围绕在条形、环形或斑片状坏死中心,并且在western blot、免疫荧光检测EPCs治疗组NF-κB表达均明显低于对照组(P<0.05)。 4、EPCs治疗组大鼠脑缺血区域MDA水平明显低于对照组(P<0.05),而SOD、GSH以及GSH-PX水平较对照组提高(P<0.05)。 5、EPCs治疗组大鼠脑组织caspase-3活性降低,Bcl-2表达上调,Bax表达下调(P<0.05)。 结论: 1、EPCs的移植后能够有效的减少脑组织梗死面积,减低缺血再灌注所导致的神经功能缺失。 2、EPCs的移植后能够向脑缺血组织迁移。 3、并在抑制NF-κB表达、抗氧化、抑制神经元细胞凋亡中发挥作用。