以Alzheimer病(Alzheimer’s disease，AD)为代表的神经退行性疾病已成为严重危害人类健康的四大杀手疾病之一。由于AD发病机理十分复杂，迄今为止尚不清楚，因此尚无理想的防治药物问世。目前临床治疗AD的药物主要为胆碱酯酶抑制剂，该类药物只能部分减轻症状，对AD患者脑内的主要病理改变并无明显改善作用，也不能延缓病情的发展，因此研究与开发疗效好、毒副作用小的新型药物是当今创新药物研究领域的攻关热点。可靠的药物筛选和研究靶标是创新药物研究与开发成功的重要前提，因此，目前在世界范围内药物作用靶标的研究倍受重视，同样也是创新药物研究领域的热点。人类基因组计划的完成和功能基因组研究的不断深入，为药物靶标的研究创造了新的条件和机遇，也提供了崭新的研究手段。大量成功事例表明，生物信息学、高性能并行计算和基因组技术与药物设计的紧密结合是快速、高效发现新靶标和获得活性化合物的有效途径，如千年药业公司运用生物信息学和基因芯片等技术，在短期内就发现了80个候选新靶标，仅用11个月的时间就完成了从药物靶标验证到候选药物的临床前研究。可见，随着各种基因组计划的进行和功能基因组计划的不断深入，籍生物信息学技术发现药物新靶标的“从基因组到药物”的研究模式，已成为现阶段国际药物研究与开发的主流。 AD的主要临床表现是学习记忆和认知功能的进行性衰退乃至丧失。大量研究已经表明，多种基因及其表达产物在中枢学习记忆和认知功能障碍发生的病理生理过程中发挥着重要的调控作用，目前公认有4个基因即Apo E-4、APP、PS-1和PS-2与AD发病密切相关，如65％的AD病人Apo E-4基因发生变异，家族性AD多由APP、PS-1和PS-2的突变所引起。此外，尚有其它许多基因在AD病人脑中表达异常。因此，基因表达或转录异常是导致AD发生、发展的重要因素之一。据估计，所有基因中有一半以上在脑中表达，其中许多仅特异性地在脑中表达，博士学位论文中文摘要这些基因多属于稀有的神经组织特异性的低表达基因。AD脑内的病理改变在发病早期以大脑内颗叶，如海马、杏仁核等最为严重，随着病程的进展，逐步累及大脑新皮层的其它区域，这些脑区发生的病理改变与神经细胞基因表达异常具有密切关系。因此，不同脑区神经细胞mRNA的差异表达谱可以作为反映神经细胞功能状态的分子指纹图谱。研究和寻找AD脑内病理相关基因，探讨其作为防治AD药物作用靶标的可行性，是研究与开发新型AD防治药物的重要前提和基础。 目前研究AD的常用动物模型主要包括自然衰老、物理或化学损毁等所致痴呆模型，虽然这些模型都具有中枢学习记忆功能障碍的表现，但缺乏AD所特有的神经病理变化。转基因或基因敲除动物模型虽有许多优点，但也不能全面反映AD的病理改变。快速老化模型小鼠(senescence一accelerated mouse，SAM)是由日本京都大学竹田教授经过筛选培育而成的老化模型小鼠，包括快速老化的P系 (sAM一prone，SAMP)和R系(S AM一resistant，SAMR)两大系，SAMP是快速老化亚系，并且有品系特异的病理表型，而SAMR则有着相对正常的生命期，在研究SAMP时常被用来作为对照。其中SAMPS亚系的特征是中枢学习记忆功能随增龄进行性快速衰退，其脑内具有多种与AD类似的病理变化如APP代谢异常及p一淀粉样蛋白含量的升高等。与快速老化亚系SAMRI相比，SAMPS病理特征明显、稳定，对药物治疗具有良好的反应，因此目前被认为是研究AD发生机理及其防治药物的较为理想的动物模型。 为寻找可用于防治AD药物筛选与研究的基因靶标，本研究以快速老化模型小 鼠SAMPS为模型，从与中枢学习功能密切有关的脑区一海马差异表达基因筛选出发，构建快速老化模型小鼠海马的抑制消减cDNA文库。在此基础上，制备了差异表达基因的cDNA芯片，对消减文库进行分析和筛选，并以表达序列标签(EST)进行生物信息学分析和验证。然后，应用所制备的基因芯片，研究了中药复方六味地黄汤和石杉碱甲对SAMPS海马差异表达基因的影响，并对其药物反应基因进 行了比较，探讨了SAMPS海马中可用于防治AD药物筛选和研究的潜在基因靶标， 为进一步深入研究打下了基础。本研究共分为五部分，一是采用高效分离差异表 达基因的抑制消减杂交技术，建立了12月龄雄性SAMRI和SAMPS海马的抑制消 减文库;二是利用所建文库的克隆，制作了海马差异表达基因的cDNA芯片，为后 续筛选提供了手段;三是运用生物信息学技术对所获得的差异表达基因进行了分 析;四是选择部分差异表达基因，利用荧光实时定量Rl’- PCR方法进行基因表达差 异的验证，对所制备芯片筛选结果的有效性和可靠性进行了确证;五是利用所制 作的芯片研究了六味地黄汤和石杉碱甲对海马差异表达基因的影响，明确上述两 个药物的反应基因。博士学位论文中文摘要一、快速老化模型小鼠SAMRI和SAMPS海马抑制消减文库的构建 在基因水平，即在mRNA水平或在cDNA水平筛选差异表达基因，其方法有多种，但大都以杂交、PCR或序列分析为基础。抑制消减杂交技术(SSH)是一种研究基因表达差异的方法，与代表性差异分析(RD