论文部分内容阅读
癌基因ErbB2,又称为HER2/neu,是人类肿瘤中发生改变频率最高的癌基因之一,编码一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,属表皮生长因子受体家族成员,其异常扩增与表达与乳腺癌的发生、发展密切相关,是乳腺癌的一个重要分子标志物和治疗靶。Herceptin（主要成分为Trastuzumab）是一种针对HER2/neu蛋白的高纯度重组DNA衍生的人源化单克隆抗体,能够特异性识别HER2/neu蛋白受体的胞外功能区,抑制其介导的信号传导路径,作为针对肿瘤细胞HER2/neu基因靶点的第一个分子靶向药物,为乳腺癌尤其是HER2/neu阳性乳腺癌的临床治疗带来了新的突破。但仍有部分HER2/neu阳性乳腺癌细胞对Herceptin具有耐药性,同时,大剂量的Herceptin对心血管系统也具有一定的毒副作用。因此,临床上多用Herceptin与其它化疗药物联合来治疗HER2/neu阳性乳腺癌。维甲类化合物（retinoids,即维生素A衍生物之统称）通过激活相应的受体调控特定基因的转录活性,从而产生调节细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学效应[1]。天然的全反式视黄酸（ATRA）、13-顺式视黄酸（13-cis RA）、9-顺式视黄酸（9-cis RA）以及合成的TTNPB等已被开发成治疗皮肤癌的药物,广泛应用于临床[2]。在天然的维甲类化合物中,全反式视黄酸和9-顺式视黄酸能激活RAR受体,而只有9-顺式视黄酸可激活RXR受体[3-4],且已有研究发现9-顺式视黄酸的衍生物能够有效抑制HER2/neu转基因小鼠乳腺癌的形成[5],提示作为RXR天然配体的9-顺式视黄酸是一种很有潜力的HER2/neu阳性乳腺癌细胞抑制剂。有鉴于此,本研究以HER2/neu阳性的MDA-MB-453细胞和转染了HER2/neu真核表达质粒的MCF-7乳腺癌裸鼠移植瘤为研究对象。利用MTT技术、流式细胞仪技术和TUNEL技术检测了Herceptin和9-顺式视黄酸联合用药对MDA-MB-453细胞增殖活性、细胞周期分布以及凋亡的影响,并利用动物实验进一步观察Herceptin和9-顺式视黄酸联合用药对MCF-7HER2细胞裸鼠移植瘤的抑制作用。另外,利用免疫印记、免疫沉淀以及RT-PCR技术检测MDA-MB-453乳腺癌细胞中ErbB2、Cyclin E、p27、CDK2、COX-2、RXRα等分子的表达及其活性,初步探讨了9-顺式视黄酸协同Herceptin抑制乳腺癌的分子机制。主要实验结果和结论如下:1. MTT,流式细胞仪分析结果显示,与单独用药和对照组相比,Herceptin和9-顺式视黄酸联合用药能够有效协同抑制MDA-MB-453细胞的增殖活性,并能将细胞周期进程阻遏于G0/G1期。2. TUNEL检测结果显示,9-顺式视黄酸和Herceptin联合作用能够有效诱导MDA-MB-453乳腺癌细胞发生凋亡,联合处理组的细胞凋亡率显著高于对照组和各单独处理组的细胞凋亡率之合。提示,Herceptin和9-顺式视黄酸能够协同作用有效诱导MDA-MB-453乳腺癌细胞发生凋亡从而起到抑制肿瘤的作用。3.本研究将MCF-7HER2细胞移植到裸鼠体内,成功构建了相应的裸鼠移植瘤模型。经一定剂量的9-顺式视黄酸和Herceptin单独或联合用药后,与对照组相比,联合处理组MCF-7HER2细胞移植瘤的体积和重量明显降低。表明,9-顺式视黄酸和Herceptin能够在体内协同抑制HER2/neu阳性乳腺癌细胞的增殖活性。4. MDA-MB-453细胞经9-顺式视黄酸、Herceptin联合处理24小时后,磷酸化、非磷酸化ErbB2蛋白表达较对照组均显著下降,但Herceptin单独处理组和联合处理组之间的差别并不明显。同时,RXRα表达无显著变化,而COX-2的表达与对照组相比也明显降低。提示Herceptin和9-顺式视黄酸可分别或协同抑制ErbB2以及COX-2的表达和活性从而抑制MDA-MB-453乳腺癌细胞的增殖能力。5. 9-顺式视黄酸、Herceptin联合处理24小时后MDA-MB-453细胞CDK2、Cyclin E的表达以及CDK2/Cyclin E激酶复合物的活性较对照组显著下降,而p27蛋白的表达则显著升高,提示9-顺式视黄酸可协同Herceptin通过影响上述G0/G1期相关分子表达和活性来阻遏HER2/neu阳性乳腺癌细胞的周期进程。综上所述,本研究证实联合运用Herceptin和9-顺式视黄酸可通过调控ErbB2、COX-2以及G0/G1期相关分子的表达和活性从而有效协同抑制HER2/neu阳性乳腺癌细胞。