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随着现代化工农业的快速发展,海洋生物毒素已经严重威胁到全人类的生命健康,尤其是离子通道类海洋毒素。它们占了总毒素的80%以上,是海洋生物毒素中分布最广危害最大的一类毒素,很可能会引发某些离子通道类疾病。传统的小鼠生物法为标准的毒素检测法,但因其种种局限(例如灵敏度低、重复性差等),已难以满足海洋毒素日常监测的需要。常规的基于化学结构的高效液相色谱分析法(HPLC),因其设备昂贵和技术复杂也难以完全取代小鼠生物法。近年来,一些基于功能活性的细胞检测法陆续发展起来,但传统的细胞检测手段较耗时且不能实时反映细胞的动态信息。细胞传感器作为一种新型的功能性细胞检测法,因其无损、高灵敏、实时动态检测等优势而备受国内外研究者的关注。目前,细胞传感器在海洋毒素研究中的应用还为数不多,它结合了细胞检测和生物传感器的各自优点,是一项十分有前景的毒素检测技术。本文选择稳态性和鲁棒性强的电兴奋心肌细胞作为敏感元件,旨在构建高性能心肌细胞阻抗和电位传感器,并将其应用于离子通道类海洋毒素的检测分析。本论文的主要创新性的工作在于：1.设计了高通量和多通道细胞电位传感器系统,实现了心肌细胞胞外场电位的高通量和多通道检测本文设计了两种细胞电位传感器芯片：单孔32通道微电极阵列(MEA)芯片和高通量16孔64通道MEA芯片。同时针对这两种MEA芯片开发了3种细胞电位传感器系统：单孔32通道细胞电位传感器、单孔8通道无线细胞电位传感器、高通量细胞电位传感器。最后通过心肌细胞胞外场电位实验,验证了三者均具备良好的胞外场电位检测功能。两种单孔多通道细胞电位传感器实现了细胞网络胞外场电位(EFP)的多位点检测。相比于单孔32通道细胞电位传感器,8通道无线细胞电位传感器在外型上实现了便携式小型化,更方便于EFP检测。高通量细胞电位传感器在单孔细胞电位传感器的基础上实现了多个细胞样本EFP的同步检测,大大提高了检测效率。2.深入研究了促进心肌细胞与传感器芯片耦合的改进方法,并成功构建了高度稳定性和一致性的心肌细胞阻抗和电位传感器本文深入研究了芯片表面蛋白修饰法和优化细胞培养密度法对心肌细胞和传感器芯片耦合的促进作用。研究结果表明,对于细胞阻抗传感器(ECIS)芯片而言,心肌细胞按优化密度12k/well(8.5万/cm2)培养在经高分子蛋白明胶修饰的96孔ECIS培养板上,可促使心肌细胞和ECIS芯片形成高度紧密的耦合。在此条件下构建的高通量心肌细胞阻抗传感器,能稳定输出一致性良好的搏动信号(搏动幅值：0.045-0.05；搏动频率：90-105次/min),信号稳定期(毒素干预的最佳时期)可以维持32h；对于MEA芯片而言,研究结果表明了心肌细胞按优化密度12万/cm2培养在经明胶修饰的单孔MEA芯片上,可促使心肌细胞和MEA芯片形成高度紧密的耦合。在此条件下构建的单孔8通道无线心肌细胞电位传感器,能稳定输出一致性良好的胞外场电位(EFP)信号(峰电位幅值：16-1.8 mv；发放频率：150-180次/min),信号稳定期可以维持60 h。本文同时选了两种典型的工具药物异丙肾上腺素和利多卡因对优化后的两种高性能心肌细胞传感器进行了分析性能的测试,实验结果表明了心肌细胞阻抗和电位传感器均对测试药物做出了正确而灵敏的响应,具备良好的检测分析功能。3.提出了高通量检测石房蛤毒素(STX)、河豚毒素(TTX)的心肌细胞阻抗传感器检测方法本文将优化后的高通量心肌细胞阻抗传感器应用于离子通道类海洋毒素的毒性评价,提出了一种新型高通量的离子通道类海洋毒素功能性检测法。我们主要研究了3种具有代表性的离子通道类海洋毒素(STX、TTX、PbTx-2)的毒性作用。通过分析毒素作用24 h后心肌细胞阻抗传感器的信号特征参数(细胞指数CI、搏动幅值BA、搏动频率BR)的变化,得出该阻抗传感器对PbTx-2的敏感性较差,对高浓度(4μM,3.6 ppm)的PbTx-2没有响应；对STX的敏感参数为BR,检出限为0.09 ng/mL,检测范围为0.25～20 nM和0.18-14.6μM；对TTX的敏感参数为BR,检出限为89 ng/mL,检测范围为0.4～20μM。该阻抗传感器实现了STX高通量高灵敏检测。心肌细胞电位传感器法具有通量高、检出限低、重复性好等优点,有望成为新型高通量的离子通道类海洋毒素检测平台。4.提出了快速检测石房蛤毒素(STX)、河豚毒素(TTX)和短裸甲藻毒素(PbTx-2)的心肌细胞电位传感器检测法基于心肌细胞阻抗传感器检测法的研究基础,本文将优化后的单孔8通道无线心肌细胞电位传感器应用于离子通道类海洋毒素的毒性评价,提出了一种新型快速的离子通道类海洋毒素功能性检测法。我们同样选择STX、TTX、 PbTx-2作为研究对象,通过分析毒素作用5 min后心肌细胞电位传感器EFP信号特征参数(峰电位幅值SA、发放频率FR、峰电位半时程SPD50)的变化,得出该电位传感器对STX和PbTx-2的敏感参数分别为FR和SPDso,检出限分别为0.35 ng/mL和1.55 ng/mL检测范围均为1.56～400 nM；对TTX的敏感参数为FR,检出限分别为83 ng/mL,检测范围为400～3200 nM。该电位传感器实现了STX和PbTx-2的快速高灵敏检测。心肌细胞电位传感器法具有简便快速、检出限低、重复性好等优点,有望成为新型快速的离子通道类海洋毒素检测平台。