研究背景结直肠癌(Colorectal Carcinoma, CRC)是现今世界上最常见的恶性肿瘤之一。在西方发达国家,其发病率居恶性肿瘤的第2位。中国每年新发病例已超过17万,发病递增速度为世界平均数的两倍,是中国发病率排第四位的恶性肿瘤性疾病。如何有效的预防和治疗CRC,是医学界关注的重要课题之一。该病的治疗随着手术技术、以氟尿嘧啶类药物为基础的联合化疗以及放疗等治疗手段的不断完善而不断更新,为患者带来新的希望。但是西医治疗过程中使用的化学合成抗肿瘤的药物普遍存在价格昂贵、毒副作用大的缺点。因此,寻找高效、低毒的药物仍是目前CRC治疗中有待解决的问题。中药苦豆子(Sophora Alopecuraides, L.)是豆科(Legum inosae)槐属多年生草本植物,目前发现,苦豆子中富含喹诺里西啶(Quinlizidine)类生物碱。此类生物碱为含氮的有机碱性化合物,抗癌作用明显,是近年来抗肿瘤药物研究的重点之一,其中苦参类生物碱如苦参碱、氧化苦参碱等之前已有抗肿瘤的多种报道。本课题组在研究中发现,槐定碱对结直肠癌有较好抑制作用,苦豆子总生物碱对溃疡性结肠炎亦具有良好治疗作用,由于溃疡性结肠炎与CRC具有显著相关性,因此本课题拟对苦豆子中的苦豆碱(ALO)进行抗结直肠癌的研究,观察其体内外作用。研究目的1.通过体外抗肿瘤实验,观察ALO对消化系肿瘤细胞株及结肠癌细胞株体外增殖抑制的作用；采用多种方法明确ALO是否能诱导结肠癌细胞产生凋亡：2.采用昆明种S180肉瘤模型,观察ALO的体内抗肿瘤作用,并考察其对细胞因子的影响；3.采用人结肠癌移植瘤裸鼠模型,观察ALO治疗结肠癌的体内作用；并考察其对细胞因子的影响；4.研究ALO诱导结肠癌细胞凋亡的分子作用机制：明确ALO是否对凋亡调控分子IL-6/JAK-STAT家族表达水平产生影响；寻找其诱导结肠癌细胞凋亡的相关信号转导通路或靶点。研究意义1.明确苦豆碱抗结直肠癌作用,为开发治疗结直肠癌的新型靶向制剂提供依据,以期进一步开发利用价廉、丰富的苦豆子资源,对人民健康、生态环境、经济发展大有裨益。2.采用现代实验方法对其药理学作用给予新的论释,为中药及其有效成分抗癌机制提供科学实证,也为结直肠癌的治疗开拓更为广阔的思路,对弘扬祖国传统医药具有重要意义。研究方法1.采用MTT法、光学及荧光显微镜观察、Hoechst 33258染色、电镜观察、荧光双染及凝胶电泳检测ALO体外抑制结肠癌细胞株SW480增殖及诱导其产生凋亡的作用。2.观察ALO对小鼠的急性毒性作用,观察其对S180肉瘤小鼠的抑瘤作用及细胞因子的能影响；观察ALO对人结肠癌移植瘤裸鼠模型的抑制作用并测定其有关细胞因子水平。3.流式细胞仪检测凋亡细胞的比例；荧光实时定量PCR检测凋亡相关基因Bcl-2、BaX、STAT3、STAT5的水平；免疫印迹法检测(?)JAK-STAT家族蛋白表达水平。主要研究结果1.MTT法检测ALO对消化系肿瘤细胞株及SW480细胞生长的影响ALO对五种肿瘤细胞株均有不同程度的增殖抑制作用；SW480细胞生长增殖抑制率随着时间和浓度的增加而增加,呈一定的时间-剂量-效应关系。对ALO作用48h的抑制率进行Probit回归分析,结果显示其IC50为1.52169mg/ml。2.形态学方面观察加药后细胞的凋亡变化光学显微镜及荧光显微镜观察细胞：ALO作用后,细胞外形变圆,折光性增强,皱缩或脱落漂浮于培养基中；贴壁生长的细胞变得稀疏、部分细胞皱缩,胞质中颗粒增多并可见细胞膜出泡。Hoechst 33258染色可见典型的凋亡形态学改变：核染色质聚集、核碎裂、胞质浓缩,被染成明亮的蓝色荧光。电镜下可见ALO处理后,细胞皱缩,胞体缩小,细胞膜表面微绒毛消失,凋亡小体出现；DNA-Ladder结果,对照组细胞DNA没有出现片段化,1.5mg/mlALO作用细胞48h后基因组DNA开始降解,出现模糊的梯状条带,72h可见非常典型的“梯状条带”；0.8 mg/mlALO作用细胞48h、72h基本形成典型条带。结果显示,低浓度长时间的作用使基因组DNA片段化更为突出。3.小鼠急性毒性结果小鼠急性毒性实验给药后,各组小鼠出现短暂自主活动减少,双目紧闭,蜷缩,随后即出现兴奋、跳跃；较低剂量组动物在半小时后状态恢复如常,活动自如；高剂量组小鼠有不同程度神经系统症状,部分小鼠给药1小时内出现死亡。对各组小鼠死亡数目进行Probit回归分析,确定其灌胃给药LD50为515.43451mg/kg,其95%可信区间为937.27360mg/kg-29296.59335mg/kg。4.ALO对S180荷瘤小鼠的抑制作用及细胞因子的影响昆明种小鼠接种S180肉瘤细胞后,各组小鼠精神状态良好,活动正常,荷瘤组瘤重达到1.50±0.32g,说明肿瘤移植成功,CTX组、ALO-H组及ALO-L组小鼠肿瘤平均重量明显低于肿瘤模型组,差异有统计学意义(P均<0.01),三组的肿瘤抑制率分别为69.3%和47.3%及39.4%,该结果说明,ALO对S180荷瘤小鼠肿瘤生长具有一定抑制作用。荷瘤组血清IL-6及VEGF含量升高,与空白对照组比较有显著性差异(P=0.000),CTX组、ALO高剂量和ALOL低剂量则含量降低,与荷瘤模型组相比差异具有显著性(P均<0.01),但各给药组无统计学差异(P值均大于0.05)说明各给药组均能降低血清IL-6及VEGF水平。5. ALO对人结肠癌移植瘤裸鼠模型的抑制作用SPF级BALB/c裸鼠皮下接种人结肠癌细胞株SW480,成瘤后,分组给药,结果显示ALO高、低剂量组及生理盐水组裸鼠精神状态均良好,活动正常；ALO各组瘤块生长缓慢,移植瘤的重量和体积增长显著低于阴性对照组(P<0.01)。ALO高剂量组和CTX组抑瘤率分别为60.41±7.90%及68.67±3.48%,且ALO高剂量组与CTX组相比,数值没有显著性差异(P>0.05)。说明ALO对人结肠癌移植瘤裸鼠模型有一定抑制作用。6.ALO抗结肠癌机制研究6.1流式细胞术检测凋亡：流式散点图可见SRI作用24h及48h后第3,4象限凋亡细胞数增多,凋亡率分别达到20.15±0.78%和29.98±1.22%,与阴性对照组比较具有显著性差异(P<0.01)。6.2实时荧光定量检测凋亡相关基因：结果显示ALO处理细胞后,与阴性对照组比较,Bcl-2、STAT3、STAT5基因表达水平显著降低(P<0.05),而BaX表达显著升高(P<0.05)。Bcl-2、STAT3、STAT5的表达与细胞凋亡及BaX的表达呈负相关。6.3免疫印迹法检钡(?)JAK-STAT家族蛋白表达：使用ALO作用于SW480细胞不同时间,结果显示0.75 mg/ml,1.5mg/ml不同浓度的ALO作用于细胞24h、48h后,高、低剂量组JAK-STAT家族蛋白表达与正常组比较有不同程度下降,并且p-STAT3的表达亦是下降,与阴性组比较差异具有显著性(P=0.000),而各组组间比较没有差异(P值均大于0.05),提示ALO可能通过影响JAK-STAT家族蛋白表达,从而抑制STAT3的磷酸化。结论1.ALO能够显著抑制结直肠癌细胞株SW480的体外增殖并诱导其产生凋亡。其抑制增殖作用呈现一定的时间-剂量-效应关系；其作用48h的IC50为1.52169mg/ml；经ALO作用后,细胞出现凋亡形态学改变和DNA片段化。2.ALO能够抑制荷S180肉瘤昆明种小鼠的肿瘤生长,并具有调节细胞因子的作用。ALO在整体实验条件下具有一定的毒性,该药对昆明小鼠一次性灌胃给药的LD50为515.43451 mg/kg。3.ALO能够抑制裸鼠接种人结肠癌移植瘤模型的肿瘤生长,具有明确的治疗结直肠癌的作用,并且能改善细胞因子IL-6及VEGF的表达。4.ALO能够增加结肠癌细胞SW480中促凋亡因子BAX基因的表达,下调JAK-STAT通路中STAT3, STAT5及Bc1-2基因；。5.ALO能够使结肠癌细胞SW480中的JAK1, JAK2, JAK3, STAT1, STAT3, STAT5, STAT6表达量明显下降,p-STAT3表达也显著降低,推测STATS蛋白可能是通过IL-6/JAK-STAT3途径参与CRC的发病过程,而ALO可能通过抑制IL-6/JAK-STAT3信号通路,减少Bcl-2、VEGF等下游促炎因子、血管生成因子的表达,调节细胞因子网络平衡,来诱导细胞产生凋亡从而抑制肿瘤生长。6.结合文献研究及实验结果,推测ALO抗结肠癌的机制之一为：ALO→SW480→IL-6/JAK-STAT3信号通路→抑制STAT3磷酸化→下游基因Bc1-2,BAX,VEGF→诱导凋亡,抑制血管生成→抑制肿瘤生长。此推断还需进一步实验证明。