帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二常见的神经退行性疾病。在我国,65岁以上人群PD的患病率大约为1.7%。其主要的临床表现为静止性震颤、运动迟缓、肌僵直和姿势不稳等运动症状。大量证据表明氧化应激、线粒体功能障碍、炎症、内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激和铁的异常聚积等都可能对多巴胺能神经元造成损伤,但是其确切的机制尚不明确。PD主要的神经病理学标志是黑质(substantia nigra,SN)中的多巴胺能神经元的缺失以及路易小体(lewy body,LB)的形成,其主要成分为聚集的α-突触核蛋白。α-突触核蛋白异常聚集是PD发病的一个关键性因素。PD另一重要的神经病理学表现是铁的异常聚积。研究表明在PD病人中,α-突触核蛋白的聚集往往伴随着铁的异常沉积。本实验室前期研究证实,在体外细胞实验中铁诱导的氧化应激能够促进α-突触核蛋白的磷酸化和异常聚集,并且可被抗氧化剂部分阻断;铁还能够通过铁调节蛋白(iron regulatory proteins,IRPs)作用于α-突触核蛋白mRNA上的铁反应元件(iron response element,IRE)(研究结果证实其是功能性的类IRE)上调α-突触核蛋白的表达;并且可能通过核转录因子(Nrf2)/血红素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)途径抑制α-突触核蛋白的降解。在体外培养的细胞中,细胞中高表达α-突触核蛋白更易受铁的损伤,而细胞干涉α-突触核蛋白后使细胞能够抵抗铁对细胞引起的氧化应激损伤。这些证据表明细胞内铁聚积和α-突触核蛋白之间的紧密关系。α-突触核蛋白以类似“朊病毒”的方式在神经元和其他类型的细胞之间扩散,有助于其病理学的传播。细胞外的α-突触核蛋白进入邻近的神经元,降低线粒体膜电位,诱导细胞凋亡等,还能够激活胶质细胞释放大量的促炎因子,进一步损伤神经元。α-突触核蛋白在细胞间传播有几种机制:细胞内表达的α-突触核蛋白可以与细胞膜结合形成囊泡以分泌到细胞外,进而通过蛋白酶和脂肪酶降解将α-突触核蛋白释放到细胞外基质中;也可通过胞吐作用分泌到细胞外基质中。细胞外的α-突触核蛋白可以通过胞吞作用和受体介导内化进入邻近的细胞。细胞间α-突触核蛋白的传播还可以通过细胞间建立隧道纳米管道。但是细胞间传递的α-突触核蛋白对细胞铁代谢的影响尚无研究报道。本研究在MES23.5多巴胺细胞上,应用免疫印迹法检测了不同浓度的α-突触核蛋白处理后铁代谢相关蛋白二价金属离子转运体1(divalent metal transposter1,DMT1)、膜铁转运蛋白(ferroportin1,FPN1)、铁调节蛋白1/2(iron regulatory protein1/2,IRP1/2)的表达变化;应用实时荧光定量PCR法,检测铁调素mRNA表达变化。用胞吞作用抑制剂Dynasore、自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)、ER应激激活剂毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)和ER应激阻断剂Salubrinal预处理后,检测铁代谢相关蛋白和ER应激相关蛋白C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、剪切型X盒结合蛋白(X-box binding protein 1s,XBP-1s)、激活转录因子4(activating transcription factor-4,ATF-4)、磷酸化α亚基的真核翻译起始因子2(phosphorylated eukaryotic translation initiation factor2α,p-eIF2α)以及转录因子环磷腺苷反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)磷酸化的变化,以阐明细胞外的α-突触核蛋白对铁代谢相关蛋白的影响,并探讨其作用机制是否与ER应激相关。研究结果如下:1.细胞活性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK8)的实验结果提示α-突触核蛋白浓度为0-20μg/ml,处理MES23.5细胞24 h后,细胞存活率不变。我们选择对细胞存活率没有影响的1μg/ml和5μg/mlα-突触核蛋白进行实验。2.1μg/ml和5μg/mlα-突触核蛋白处理MES23.5细胞24 h后,1μg/ml处理组DMT1蛋白水平有升高趋势,5μg/mlα-突触核蛋白处理组DMT1蛋白表达升高32.26%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.01);1μg/ml和5μg/mlα-突触核蛋白处理组与对照组相比,FPN1蛋白表达分别下降25.14%和26.75%,差别有统计学意义(P<0.01)。结果表明,α-突触核蛋白能够诱导DMT1蛋白表达上调和FPN1蛋白表达下调。3.1μg/ml和5μg/mlα-突触核蛋白处理MES23.5细胞24 h后,1μg/ml处理组铁调素mRNA水平有升高趋势,5μg/mlα-突触核蛋白处理组铁调素mRNA升高3.05倍,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.01)。结果表明,α-突触核蛋白能够诱导铁调素mRNA水平上调。4.1μg/ml和5μg/mlα-突触核蛋白处理MES23.5细胞24 h后,1μg/ml处理组IRP1蛋白水平有升高趋势,5μg/mlα-突触核蛋白处理组IRP1蛋白升高25.47%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.01)。1μg/ml和5μg/mlα-突触核蛋白处理组IRP2蛋白水平分别升高37.94%和60.27%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.01)。结果表明,α-突触核蛋白能够诱导IRP1和IRP2蛋白表达上调。5.CCK8实验结果提示Dynasore浓度为50μM时细胞存活率明显降低,10μM Dynasore不影响细胞存活率。Dynasore(10μM)预处理MES23.5细胞30 min后与α-突触核蛋白(5μg/ml)共处理24 h,共处理组与单独α-突触核蛋白处理组相比,铁调素mRNA表达水平明显降低,IRP1、IRP2和DMT1蛋白表达水平明显降低,FPN1蛋白表达明显升高,差别有统计学意义(P<0.01)。且共处理组与对照组相比,铁调素mRNA表达水平一致;IRP1蛋白表达水平明显下降;IRP2蛋白表达水平一致;DMT1蛋白表达水平明显下降,提示Dynasore能够完全阻断α-突触核蛋白引起的铁调素mRNA、IRP1蛋白、IRP2蛋白和DMT1蛋白表达变化。共处理组与对照组相比,FPN1蛋白水平仍有降低,提示Dynasore不能完全阻断α-突触核蛋白引起的FPN1蛋白表达变化。Dynasore单独处理不影响上述mRNA和蛋白的表达水平。6.CCK8实验结果提示雷帕霉素浓度为100 nM不影响细胞存活率。雷帕霉素(100 nM)单独处理MES23.5细胞24 h后,铁调素mRNA表达水平明显上升。雷帕霉素预处理MES23.5细胞30 min后与α-突触核蛋白(5μg/ml)共处理24 h,雷帕霉素和α-突触核蛋白共处理组与单独α-突触核蛋白组相比,铁调素mRNA表达水平进一步上升,IRP1蛋白、DMT1蛋白表达水平明显降低,FPN1蛋白表达明显升高,差别有统计学意义(P<0.01);共处理组与对照组相比,铁调素mRNA表达水平明显升高,IRP2蛋白表达水平相一致,IRP1蛋白和DMT1蛋白表达水平明显下降,FPN1蛋白表达明显升高,差别有统计学意义(P<0.01)。7.1μg/ml和5μg/mlα-突触核蛋白处理MES23.5细胞24 h后,1μg/ml处理组ER应激相关蛋白CHOP、ATF-4、XBP-1s蛋白表达分别升高41.47%,48.97%,61.51%;5μg/ml处理组CHOP、ATF-4、XBP-1s、p-eIF2α蛋白表达分别升高39.66%,1.54倍,58.31%,20.30%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.01)。以上结果说明细胞外的α-突触核蛋白能够引起细胞发生ER应激。8.0.1μM和1μM的TG处理MES23.5细胞24 h后,CHOP蛋白分别升高37.36%和71.15%,XBP-1s蛋白表达分别升高96.02%和1.55倍,p-eIF2α蛋白在1μM TG处理组升高34.75%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.01),提示TG能够引起细胞内ER应激。在0.1μM和1μM TG处理组,铁调素mRNA水平分别上调3.28倍和3.7倍,IRP1蛋白分别上调3倍和5.4倍,在0.1μM处理组IRP2蛋白上调46.23%,DMT1蛋白水平分别上调53.59%和68.17%,FPN1蛋白水平分别降低20.41%和52.26%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.01)。以上结果说明细胞发生ER应激影响铁代谢相关蛋白表达。9.CCK8结果提示Salubrinal浓度为10μM不影响细胞存活率。Salubrinal(10μM)预处理MES23.5细胞30 min后与α-突触核蛋白(5μg/ml)共处理24 h,共处理组与单独α-突触核蛋白组相比,CHOP蛋白表达水平明显下降,铁调素mRNA、IRP1蛋白和IRP2蛋白表达水平明显降低;共处理组与对照组相比,CHOP蛋白表达水平相一致,IRP1蛋白和IRP2蛋白表达水平相一致,但铁调素mRNA表达水平仍有升高。提示Salubrinal能够阻断α-突触核蛋白引起的细胞内ER应激和IRP1、IRP2的表达上调,但不能完全阻断α-突触核蛋白引起的铁调素的表达上调。以上结果说明ER应激可能参与了进入细胞内的α-突触核蛋白对铁调素和IRPs的调控而影响铁代谢相关蛋白的表达。10.1μg/ml和5μg/mlα-突触核蛋白处理MES23.5细胞24 h后,1μg/ml处理组p-CREB蛋白水平有升高趋势,5μg/mlα-突触核蛋白处理组p-CREB蛋白表达升高98.18%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。Salubrinal(10μM)预处理MES23.5细胞30min后与α-突触核蛋白(5μg/ml)共处理24 h,共处理组与单独α-突触核蛋白组相比,p-CREB蛋白水平明显降低,以上结果说明α-突触核蛋白可能通过ER应激诱导CREB的磷酸化从而调节铁代谢。11.1μg/ml和5μg/mlα-突触核蛋白处理星形胶质细胞24 h后,1μg/ml和5μg/mlα-突触核蛋白处理组与对照组相比,铁调素mRNA,IRP1、IRP2、DMT1和FPN1蛋白表达水平不变。以上结果表明,细胞外的α-突触核蛋白能够引起MES23.5细胞铁转入蛋白DMT1表达水平升高和铁转出蛋白FPN1表达水平降低,且α-突触核蛋白能够引起MES23.5细胞铁调素mRNA水平,IRP1和IRP2蛋白表达水平升高,提示其可能通过铁调素和IRPs调控DMT1和FPN1蛋白表达。Dynasore处理能够阻断α-突触核蛋白引起的铁调素和IRPs变化。自噬诱导剂雷帕霉素能够阻断α-突触核蛋白引起的IRPs变化,然而可诱导铁调素的mRNA表达水平进一步升高,提示可能细胞内自噬水平直接影响铁调素mRNA的表达。这些结果提示细胞外的α-突触核蛋白可以进入细胞内引起上述改变。α-突触核蛋白能够引起MES23.5细胞ER应激相关蛋白CHOP、ATF4、XBP-1s和p-eIF2α表达水平升高,且与ER应激诱导剂TG的作用一致。而ER应激的阻断剂Salubrinal也能够阻断α-突触核蛋白引起的铁调素和IRPs变化。CREB的磷酸化可被Salubrinal部分阻断,提示其部分可能参与了ER应激对IRPs的表达调控。以上结果说明细胞外的α-突触核蛋白可能进入到细胞内,通过ER应激,调控铁调素和IRPs来影响铁代谢相关蛋白的表达,并部分与CREB的磷酸化有关。本实验在MES23.5细胞和星形胶质细胞中探讨了铁代谢相关蛋白与细胞外α-突触核蛋白之间的关系,为进一步阐明PD发病过程中铁代谢异常与α-突触核蛋白相互作用的机制提供了新的实验依据。