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研究表明,环境内分泌干扰物(endocrine disturbance chemicals, EDCs)的大量排放和持久存在已对动物及人类的生殖健康造成严重危害[1],有机氯农药是典型的EDCs。有机氯农药滴滴涕(2,2-bis(4-chlorophenyl)-1,1,1-trichloroethane, DDT)和六六六(benzene- hexachloride, BHC)曾在上世纪广泛生产和使用,虽已发现其对环境和生物体的不利影响并随后禁用,但由于其难降解、易蓄积、可以通过食物链而使生物体内蓄积水平层层放大等特性,在人体内仍有较高的残留水平和检出水平。p,p’-DDE、β-BHC分别是DDT和BHC的主要代谢产物,易蓄积于脂肪组织中而难以排出体外,其内分泌干扰效应长远,因而成为研究热点。近年来,随着细胞信号转导通路的研究进展,尤其是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protain kinase,MAPK)信号通路在调节细胞增殖、分化、凋亡中的重要作用被发现,引起了人们对有机氯农药通过激活细胞MAPK通路而干扰精子发生过程的关注。本实验室前期已证实了p,p’-DDE、β-BHC及两者联合作用都能通过MAPK通路中JNK、p38途径诱导睾丸支持细胞凋亡,本实验正是在此基础上,将睾丸组织设为研究对象,同样以JNK途径为例研究受试物的作用机制。组织水平上支持细胞与生殖细胞的共培养体系是本实验的创新之处。第一部分大鼠睾丸组织体外培养、形态鉴定及凋亡分析目的:建立睾丸组织体外培养方法(组织水平上支持细胞与生殖细胞共培养体系),并探讨p,p’-DDE、β-BHC及两者联合作用对该体系的影响。方法:将大鼠睾丸组织剪碎至2mm3左右小块在DMEM培养基中培养,分5组,各组分别培养1、2、3、4、5天后固定、石蜡包埋并进行HE染色及TUNEL染色。以终浓度分别为10μmol/L、30μmol/L、50μmol/L p,p’-DDE,β-BHC及该浓度下两者1:1混合液对离体培养24h的组织块进行染毒,用TUNEL法检测早期凋亡的细胞,以观察p,p’-DDE、β-BHC及两者联合作用对组织块中细胞凋亡情况的影响。结果:正常组织块在此种培养模式下存活良好,细胞凋亡较少。经染毒的组织块生精小管形态改变、细胞黄染增加、细胞数减少,与对照相比均有显著差异,p<0.001。结论:可以组织块培养为手段构建支持细胞与生殖细胞的共培养模型,p,p’-DDE,β-BHC及两者联合作用都对该模型中细胞产生不利影响。第二部分p,p’-DDE,β-BHC及其联合作用对大鼠睾丸组织jnk mRNA表达的影响目的:探讨p,p’-DDE、β-BHC及二者联合作用对睾丸组织总jnk mRNA表达的影响。方法:用实时荧光定量PCR法半定量检测不同浓度p,p’-DDE、β-BHC及二者联合作用下jnk mRNA的表达情况。结果:各染毒组jnk与β-actin mRNA表达量比值相对于对照组均有升高,p<0.05,p,p’-DDE和β-BHC单独染毒组,随着浓度的增加,mRNA表达量呈先下降后上升的趋势,而当两者联合作用时,随着浓度的增加,mRNA表达量呈先上升后下降的趋势,且30μmol/L染毒剂量下,联合作用与单独作用相比有统计学差异。结论:受试物单独及联合作用下,支持细胞和生精细胞在反应机制、起始时间及反应结果上不相同。30μmol/L单独作用时,组织中总mRNA的转录水平有所降低;联合作用时,30μmol/L则促进jnk mRNA高表达,呈现一定的协同作用。第三部分p,p’-DDE,β-BHC及其联合作用对大鼠睾丸组织Jnk蛋白表达的影响目的:探讨p,p’-DDE、β-BHC及二者联合作用对睾丸组织Jnk蛋白表达的影响。方法:用Western blotting半定量检测不同浓度p,p’-DDE、β-BHC及二者联合作用对总Jnk1/2及p-Jnk1/2蛋白表达情况。结果:各染毒组总Jnk1/2的表达量与对照组相比无明显差异,但p-Jnk1/2蛋白表达量与对照组相比均显著升高,p<0.05。p,p’-DDE,β-BHC两者单独作用时,随着染毒剂量的升高,p-Jnk1、p-Jnk2及两者总表达量均呈先下降后上升的趋势,且各自低浓度组、高浓度组与中浓度组比较差异有显著性(p<0.01),两者联合作用时,p-Jnk1、p-Jnk2及两者总表达量均呈先上升后下降的趋势,低浓度组、高浓度组与中浓度组比较差异有显著性(p<0.01)。p-Jnk2的表达量均高于p-Jnk1。结论:生精小管上皮不同种类的细胞对p,p’-DDE,β-BHC作用的反应机制存在差异。单独作用时,生精细胞p-Jnk1/2在中浓度作用下出现抑制;联合作用时,生精细胞在低浓度时出现抑制,高浓度时,大量生精细胞已先于支持细胞凋亡。以上结果证实,有机氯农药p,p’-DDE、β-BHC均可通过激活JNK MAPK通路而诱导大鼠睾丸组织生精小管上皮细胞发生凋亡,对生殖系统造成不利影响,但不同种类的细胞对该诱导的反应机制存在差异。