论文部分内容阅读
流行性感冒（简称流感）的爆发流行已经成为了对公共健康的严峻考验，其频繁变异引起的新突发人禽流感，更时常伴随着较高的致病致死率，为人类社会带来了沉重的负担和危害。流感病毒感染宿主后，除了病毒的复制增殖会对机体组织带来直接伤害，感染后往往会诱发过度的免疫炎症反应，造成宿主机体的二次伤害，目前常用的抗流感抗炎治疗药物已经面临着耐药率高、副作用大的困扰。在长期的临床应用中已经发现中药对流感起着良好的治疗作用，目前从传统中药中发掘可行的新型抗病毒药物已经成为了当下重要的研究方向。传统中药臭灵丹，作为中国具有民族以及地方特色的民间常用中草药，在既往的基础或临床研究中已被证实对时行感冒具有一定的防治作用，然而对于其中有效的活性成分尚未完全明确。在前期通过对其进行活性追踪研究已发现臭灵丹中的总黄酮、倍半萜类等组分具有抑制流感病毒及其介导炎症相关通路的激活。
目的：
1.通过体内实验明确臭灵丹总黄酮部位的抗流感和调节炎症的效果，再逐一探索从臭灵丹总黄酮成分分离所得的单体化合物抗流感及其介导炎症的药效，通过研究臭灵丹黄酮类化合物对流感病毒感染宿主所引起的相关信号通路以及细胞因子、趋化因子变化的调节作用，探索臭灵丹黄酮类化合物治疗流感的药理机制。
2.根据前期活性追踪成果已证实臭灵丹倍半萜成分有着确切的抗流感效果，本研究希望通过其与不同化学药物的联合用药进行抗病毒治疗，寻找可以与其产生协同作用的化学药物，为臭灵丹可以更精准服务于临床治疗展开了探索。
方法：
1.通过运用液相色谱法从臭灵丹总黄酮成分中分离出多个黄酮化合物单体并对其进行结构鉴定。
2.进行体内抗流感病毒及其介导炎症的药效实验，明确总黄酮部位的抗流感抗炎效果，将总黄酮药物，分高、低剂量组(200mg/kg·d、100mg/kg·d)，和阳性药物磷酸奥司他韦(60mg/kg·d)预防给药1天后，继续对流感感染小鼠给药治疗5天，分别观察小鼠体重变化、死亡保护、肺病毒滴度、肺病理变化情况等指标明确总黄酮部位的体内抗流感效果。
3.对于分离所得黄酮类化合物，采用噻唑蓝染色法（MTT法）、细胞病变抑制法(CPE，Cytopathic Effect)分别观察各个化合物的细胞毒性以及体外对流感病毒的抑制作用。
4.利用蛋白免疫印迹技术检测黄酮化合物对流感病毒感染相关的宿主细胞信号通路影响，包括p38/MAPK，NF-κB，STAT-3等，以实时荧光定量PCR技术检测各黄酮化合物对流感病毒诱导的细胞因子及趋化因子信使RNA表达水平的影响。
5.通过联合用药的方法对已明确具有抗病毒药效的臭灵丹倍半萜类成分进行应用探索，研究其联合不同类型的抗病毒化学药物在体外治疗不同亚型的流感病毒所起的药效作用。
成果：
1.从总黄酮中分离得到6个黄酮类单体化合物，并分别鉴定出其各自的结构分别为5，6-二羟基-3，7，4-三甲氧基黄酮、蔓荆子黄素、5，4-二羟基-6，7，-二甲氧基黄酮、5-羟基-3，6，7，3，4-五甲氧基黄酮、5，4-二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮以及5，4-二羟基-3，5，7，4-四甲氧基黄酮。
2.臭灵丹总黄酮部位的体内药效结果：臭灵丹总黄酮对感染甲型流感病毒FM1株小鼠具有一定的炎症调节作用，药物组(200、100mg/kg·d》可有效降低流感病毒感染小鼠的肺指数，与病毒组比较具有统计学差异;肺组织病理结果显示臭灵丹总黄酮高剂量治疗组(200mg/kg·d)的肺组织病理炎症性改变较病毒组有一定程度的减轻（P＜0.05），总黄酮治疗组对流感病毒感染小鼠肺泡灌洗液中的IL-6、IP-10等炎症因子也能起到调节作用，与病毒组比较具有统计学差异（P＜0.05）。但臭灵丹总黄酮治疗组并不能改善病毒感染引起的小鼠体重下降，对流感感染小鼠也没有死亡保护作用，对肺病毒滴度测定提示该药物无直接抑制流感病毒在小鼠体内的复制增殖作用（P＞0.05）。
3.从臭灵丹总黄酮中分离得到的多个黄酮化合物单体在体外对MDCK细胞的半数毒性浓度在8-13μg/mL范围。通过体外抑制流感病毒实验测得的选择指数SI表明，分离所得的化合物对各个亚型的流感病毒无体外抑制作用。
4.臭灵丹黄酮化合物在不同浓度下可分别抑制甲型H1N1流感病毒感染细胞介导的趋化因子CCL-5、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)、巨噬细胞炎性蛋白1(MIP-1α)、趋化因子CXCL9(又称MIG)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)的mRNA表达，具有统计学意义（P＜0.05），并具有一定的量效关系。
臭灵丹黄酮化合物5-羟基-3，6，7，3，4-五甲氧基黄酮和黄酮化合物5，4-二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮在3μg/mL、10μg/mL、30μg/mL浓度下可对p38/MAPK、STAT3、NF-Kb等信号通路的磷酸化起到一定的抑制作用。
5.臭灵丹酸联合奥司他韦、利巴韦林、金刚烷胺在体外治疗模式下分别作用于甲型H1N1、H3N2以及乙型流感感染的MDCK细胞，两两之间的协同值范围在-50-50nM2％之间，互相之间主要表现为相加的协同效应。
结论：
臭灵丹总黄酮部位对于流感病毒感染引起的炎症反应具有良好的调节作用，其中包含的黄酮类化合物可能是其活性效果的物质基础，本研究中从总黄酮部位分离所得的六个黄酮类单体化合物中，其中五个对于流感介导炎症相关信号通路及炎症因子均能起良好的调节作用，显示其在抗流感治疗中能起到对免疫炎症反应的调节作用。臭灵丹倍半萜类成分在体外联合用药研究中均表现出相加效应，在进一步的研究中仍然有希望探寻到与其起协同效应的药物。
目的：
1.通过体内实验明确臭灵丹总黄酮部位的抗流感和调节炎症的效果，再逐一探索从臭灵丹总黄酮成分分离所得的单体化合物抗流感及其介导炎症的药效，通过研究臭灵丹黄酮类化合物对流感病毒感染宿主所引起的相关信号通路以及细胞因子、趋化因子变化的调节作用，探索臭灵丹黄酮类化合物治疗流感的药理机制。
2.根据前期活性追踪成果已证实臭灵丹倍半萜成分有着确切的抗流感效果，本研究希望通过其与不同化学药物的联合用药进行抗病毒治疗，寻找可以与其产生协同作用的化学药物，为臭灵丹可以更精准服务于临床治疗展开了探索。
方法：
1.通过运用液相色谱法从臭灵丹总黄酮成分中分离出多个黄酮化合物单体并对其进行结构鉴定。
2.进行体内抗流感病毒及其介导炎症的药效实验，明确总黄酮部位的抗流感抗炎效果，将总黄酮药物，分高、低剂量组(200mg/kg·d、100mg/kg·d)，和阳性药物磷酸奥司他韦(60mg/kg·d)预防给药1天后，继续对流感感染小鼠给药治疗5天，分别观察小鼠体重变化、死亡保护、肺病毒滴度、肺病理变化情况等指标明确总黄酮部位的体内抗流感效果。
3.对于分离所得黄酮类化合物，采用噻唑蓝染色法（MTT法）、细胞病变抑制法(CPE，Cytopathic Effect)分别观察各个化合物的细胞毒性以及体外对流感病毒的抑制作用。
4.利用蛋白免疫印迹技术检测黄酮化合物对流感病毒感染相关的宿主细胞信号通路影响，包括p38/MAPK，NF-κB，STAT-3等，以实时荧光定量PCR技术检测各黄酮化合物对流感病毒诱导的细胞因子及趋化因子信使RNA表达水平的影响。
5.通过联合用药的方法对已明确具有抗病毒药效的臭灵丹倍半萜类成分进行应用探索，研究其联合不同类型的抗病毒化学药物在体外治疗不同亚型的流感病毒所起的药效作用。
成果：
1.从总黄酮中分离得到6个黄酮类单体化合物，并分别鉴定出其各自的结构分别为5，6-二羟基-3，7，4-三甲氧基黄酮、蔓荆子黄素、5，4-二羟基-6，7，-二甲氧基黄酮、5-羟基-3，6，7，3，4-五甲氧基黄酮、5，4-二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮以及5，4-二羟基-3，5，7，4-四甲氧基黄酮。
2.臭灵丹总黄酮部位的体内药效结果：臭灵丹总黄酮对感染甲型流感病毒FM1株小鼠具有一定的炎症调节作用，药物组(200、100mg/kg·d》可有效降低流感病毒感染小鼠的肺指数，与病毒组比较具有统计学差异;肺组织病理结果显示臭灵丹总黄酮高剂量治疗组(200mg/kg·d)的肺组织病理炎症性改变较病毒组有一定程度的减轻（P＜0.05），总黄酮治疗组对流感病毒感染小鼠肺泡灌洗液中的IL-6、IP-10等炎症因子也能起到调节作用，与病毒组比较具有统计学差异（P＜0.05）。但臭灵丹总黄酮治疗组并不能改善病毒感染引起的小鼠体重下降，对流感感染小鼠也没有死亡保护作用，对肺病毒滴度测定提示该药物无直接抑制流感病毒在小鼠体内的复制增殖作用（P＞0.05）。
3.从臭灵丹总黄酮中分离得到的多个黄酮化合物单体在体外对MDCK细胞的半数毒性浓度在8-13μg/mL范围。通过体外抑制流感病毒实验测得的选择指数SI表明，分离所得的化合物对各个亚型的流感病毒无体外抑制作用。
4.臭灵丹黄酮化合物在不同浓度下可分别抑制甲型H1N1流感病毒感染细胞介导的趋化因子CCL-5、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)、巨噬细胞炎性蛋白1(MIP-1α)、趋化因子CXCL9(又称MIG)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)的mRNA表达，具有统计学意义（P＜0.05），并具有一定的量效关系。
臭灵丹黄酮化合物5-羟基-3，6，7，3，4-五甲氧基黄酮和黄酮化合物5，4-二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮在3μg/mL、10μg/mL、30μg/mL浓度下可对p38/MAPK、STAT3、NF-Kb等信号通路的磷酸化起到一定的抑制作用。
5.臭灵丹酸联合奥司他韦、利巴韦林、金刚烷胺在体外治疗模式下分别作用于甲型H1N1、H3N2以及乙型流感感染的MDCK细胞，两两之间的协同值范围在-50-50nM2％之间，互相之间主要表现为相加的协同效应。
结论：
臭灵丹总黄酮部位对于流感病毒感染引起的炎症反应具有良好的调节作用，其中包含的黄酮类化合物可能是其活性效果的物质基础，本研究中从总黄酮部位分离所得的六个黄酮类单体化合物中，其中五个对于流感介导炎症相关信号通路及炎症因子均能起良好的调节作用，显示其在抗流感治疗中能起到对免疫炎症反应的调节作用。臭灵丹倍半萜类成分在体外联合用药研究中均表现出相加效应，在进一步的研究中仍然有希望探寻到与其起协同效应的药物。