【摘 要】
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十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis,简称贾第虫)是一种人兽共患寄生性原虫,也是引起人类腹泻病的重要病原之一。水源污染是贾第虫病大面积流行的重要原因,因此贾第虫也是我国城市供水的必检指标。贾第虫还是一种重要的食源性寄生虫病原,在美国因食源性污染造成的贾第虫感染占比高达15%[1]。贾第虫病流行广泛,严重危害人类和动物的健康。贾第虫病的治疗多采用化学药物(如甲硝唑),存在易产生耐药性
【基金项目】
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国家自然科学基金(31772732); 吉林省科技计划(20210506017ZP); 长春市科技计划(21ZY24)项目;
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十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis,简称贾第虫)是一种人兽共患寄生性原虫,也是引起人类腹泻病的重要病原之一。水源污染是贾第虫病大面积流行的重要原因,因此贾第虫也是我国城市供水的必检指标。贾第虫还是一种重要的食源性寄生虫病原,在美国因食源性污染造成的贾第虫感染占比高达15%[1]。贾第虫病流行广泛,严重危害人类和动物的健康。贾第虫病的治疗多采用化学药物(如甲硝唑),存在易产生耐药性、不良反应严重等问题。针对贾第虫致病性及相关免疫机制的研究,对贾第虫新药的开发及疫苗的研制具有深远意义。贾第虫不同组分或分泌的蛋白可参与调控宿主免疫应答,而程序性细胞死亡作为宿主防御病原的一种重要手段,受贾第虫何种蛋白调控缺乏详尽报道。细胞焦亡是近几年明确的一种炎症性程序性细胞死亡,属于天然免疫防御机制中的一环,多发生于免疫细胞(如巨噬细胞、树突状细胞),在宿主清除病原体过程中发挥重要作用。贾第虫及其分泌的胞外囊泡具有激活宿主免疫反应(如炎症小体、MAPK信号通路)的能力[2],能够诱导IL-6、IL-17、IL-1β等炎性细胞因子分泌,何种蛋白参与调控该过程还需要进一步研究。实验室前期研究发现硫氧还蛋白是贾第虫胞外囊泡的重要组分,而贾第虫胞外囊泡能够内化进入小鼠腹腔巨噬细胞内[2]。贾第虫胞外囊泡能激活宿主小鼠腹腔巨噬细胞发生炎性反应[3],是否与贾第虫诱导的细胞焦亡相关尚不清楚,硫氧还蛋白是否参与贾第虫诱导的细胞焦亡相关的炎性反应过程仍未可知。因此,本试验以贾第虫和小鼠巨噬细胞为研究对象,探究贾第虫、贾第虫硫氧还蛋白与细胞焦亡间的联系,以期进一步阐明贾第虫相关的免疫机制及调控策略,为贾第虫病的防治提供理论依据。1)贾第虫诱导小鼠腹腔巨噬细胞焦亡研究。通过ELISA检测发现活贾第虫能诱导小鼠巨噬细胞IL-1β分泌量显著上升,LDH检测发现贾第虫能诱导高水平的LDH释放至胞外,免疫荧光观察发现贾第虫能够引起GSDMD的聚集,Western-blot检测后发现贾第虫刺激巨噬细胞后能够诱导caspase-1的活化、IL-1β的成熟及GSDMD打孔片段的生成,由此说明贾第虫能够诱导小鼠腹腔巨噬细胞焦亡。通过Western-blot和ELISA的进一步研究发现,贾第虫诱导的小鼠腹腔巨噬细胞焦亡随刺激时间的延长(0-24 h内)及刺激剂量的增大而增加,这一过程具有时间依赖性和剂量依赖性。利用GSDMD缺失细胞进行验证发现,相比野生型细胞,在Gsdmd-/-组培养上清中不能检测到caspase-1活性片段及IL-1β成熟片段的分泌,ELISA检测发现贾第虫刺激后Gsdmd-/-组IL-1β分泌量显著低于WT组,Gsdmd-/-组滋养体数量多于WT组,小鼠增重率低于WT组。以上结果说明贾第虫能诱导小鼠腹腔巨噬细胞焦亡,表现为caspase-1的活化及IL-1β的成熟和分泌,且这一过程受贾第虫活性、贾第虫刺激时间及贾第虫刺激剂量影响,由GSDMD介导的小鼠腹腔巨噬细胞焦亡在引发宿主炎症反应、清除贾第虫感染过程中发挥重要作用;2)贾第虫硫氧还蛋白(Gd TRX)诱导小鼠腹腔巨噬细胞焦亡研究。利用实验室前期分离的贾第虫胞外囊泡的蛋白组学数据选择Gd TRX为研究对象,构建p ET-28a-Gd Trx表达载体进行原核表达并纯化,获得重组贾第虫硫氧还蛋白(r Gd TRX)。r Gd TRX刺激细胞后,ELISA检测发现IL-1β分泌量显著上升,LDH释放量显著增加,Western-blot检测发现r Gd TRX能导致细胞GSDMD切割活化,由此说明r Gd TRX能够诱导细胞焦亡。分析调控该过程的上游信号通路,发现r Gd TRX能够促进NF-κB信号通路中P65、IκB的磷酸化,当NF-κB信号通路被抑制后r Gd TRX诱导的IL-1β分泌量及LDH释放量均显著降低。说明重组贾第虫硫氧还蛋白r Gd TRX能够通过NF-κB信号通路诱导小鼠腹腔巨噬细胞发生焦亡。综上,贾第虫能够诱导小鼠腹腔巨噬细胞发生细胞焦亡,其中贾第虫硫氧还蛋白可通过激活NF-κB信号通路调控小鼠腹腔巨噬细胞焦亡反应的发生及促炎细胞因子IL-1β的分泌。小鼠腹腔巨噬细胞焦亡是贾第虫诱发宿生炎性反应的重要原因之一。
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