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规模化养殖业的迅速发展,在解决人类肉、蛋、奶需求的同时,也带来环境污染的风险。大量畜禽粪便污染物的产生,使得人类赖以生存的自然环境受到威胁。畜禽粪便中含有的大量病原微生物,可以通过各种途径传播给人类,进而感染疾病。沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是三种主要的食源性病原菌,近年来关于三种病原菌引发食物中毒的报道较多,大多数感染与食用受污染的牛奶、碎牛肉、水和乳制品有关。食源性疾病因其高发病率和给社会带来的危害而日益成为一个重要的公共卫生问题,因此,对食源性病原菌进行快速、准确的检测是控制和预防人类食源性病原菌感染的最有效途径之一。本研究通过建立基于多重聚合酶链式反应(PCR)和表面增强拉曼散射(SERS)的沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌检测方法,优化检测方案,提高食源性病原菌检测效率,对食源性病原菌的监测具有重要意义。主要研究内容如下:1.基于多重PCR技术的三种食源性病原菌检测方法的建立分别以病原菌uid A、hil A和clf A的基因序列为靶点,设计大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的特异性引物,验证引物间无交叉反应。优化后的多重PCR扩增条件的退火温度为56℃,引物浓度为2μmol/L,Taq mix酶的用量为12.5μL。多重PCR特异性试验验证阳性菌株均扩增出目的片段,阴性菌株均未扩增出条带。多重PCR敏感性试验检测到多重PCR反应的最低检测限为10~4CFU/m L,最低检出DNA量为50 pg/μL,具有较高的灵敏度。2.基于SERS技术的三种食源性病原菌检测方法的建立以制备的银溶胶作为增强基底,紫外-可见-近红外分光光度计检测到银胶的吸收峰在410 nm左右,透射电镜观察银纳米颗粒呈球状,大小均匀,粒径约40 nm,电镜下可观察到银纳米颗粒均匀包裹在菌体表面,显著增强了检测信号。在785 nm波长的激光器下优化采集参数,最优的参数分别是激光功率100 m W、采谱时间60 s、循环次数1次、狭缝孔径200μm。三种细菌的拉曼归属分析表明,沙门氏菌ATCC 9150有10处明显的拉曼特征峰,大肠杆菌CMCC 44102和金黄色葡萄球菌ATCC 6538各有9处明显的特征峰,PCA分析的前两个主成分包含了大部分光谱数据所具有的信息,累积贡献率达93.8%。SERS检测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低检出限为10~4CFU/m L,沙门氏菌最低检出量为10~3CFU/m L。3.多重PCR和SERS技术在畜禽粪便及污染水体检测中的应用多重PCR人工污染样品的检测以及粪便基因组提取与增菌液提取DNA的比较均验证了多重PCR方法的可靠性。使用建立的多重PCR方法检测从养殖场采集42份畜禽粪便,其中在22份猪粪便样品中,全部检测到大肠杆菌,检测出8份沙门氏菌;在20份鸡粪便样品,全部只检测到大肠杆菌。多重PCR方法共检测18份污水样品,全部检测到大肠杆菌,其中沙门氏菌检出8份。所有样品中均未检测出金黄色葡萄球菌。建立的SERS方法采集拉曼信号,60个样品中大肠杆菌检出60份,沙门氏菌检出19份,金黄色葡萄球菌未检测出。多重PCR方法的沙门氏菌检出率为26.7%,SERS技术的沙门氏菌检出率为31.6%。结论:(1)成功地建立了可特异性检测沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌纯培养物的多重PCR和SERS技术,在临床应用中可以检测出畜禽养殖场粪便与污水中的大肠杆菌和沙门氏菌。(2)与多重PCR相比,本研究建立的SERS方法提高了沙门氏菌的检测限,敏感度更高。在临床应用中SERS技术的沙门氏菌检出率高于多重PCR方法,而且SERS只需要培养的细菌在液体池中进行拉曼扫描和结果比对,相对缩短了检测时间。