背景胰腺癌是一种临床上预后较差的肿瘤,早期症状不典型,进展迅速,复发率高,其诊断和治疗都存在较大困难,而胰腺癌的病理和分子机制有待进一步探索。目前对胰腺癌的诊疗研究集中在分子免疫、微小RNA(microRNAs)、细胞通路和EMT等方面。而有证据提示microRNA在肿瘤发生发展过程中起到重要的作用。微小RNA(microRNAs)是一类存在于多种细胞内的小分子RNA的统称,它的序列结构保守,主要功能是调控mRNA的表达。microRNAs与靶基因作用后,可以进一步调控下游基因的表达。microRNAs在人类调控了相当数量的有效编码基因。它在不同组织器官还具有特异性,调控涉及多种细胞事件,从而影响整个细胞系的分子生物学行为,使其成为近期转化医学研究的热点。在microRNAs的诸多分型中,miR1271脱颖而出,在多种肿瘤研究中表现出其独特的分子生物学作用。而目前在胰腺癌中尚缺乏此类报道,本研究旨在探索miR1271在胰腺癌治疗中的作用及可能机制。第一部分miR1271在胰腺癌组织标本及血清中的表达材料与方法胰腺癌组织、癌旁组织及血清来自签署过知情同意书的17位胰腺癌患者。对照组血清样品来自与17位患者配对的健康志愿者。经离心震荡法处理血清后,Trizol法提取RNA后备用。组织蛋白提取后,采用BCA法测定蛋白浓度,再根据蛋白标准品浓度及其对应的分光光度值,构建函数及标准曲线,换算出样品的蛋白浓度。蛋白表达情况的测定采用Westernblot法。组织RNA经Trizol法提取后,通过qRT-PCR测定mRNA转录水平。结果与癌旁组织相比,胰腺癌组织的miR1271呈低表达现象,而血清中miR1271表达的差异不明显。PCR结果显示,胰腺癌组织的PDK1基因表达显著升高;同样血清中PDK1的这种表达差异也不具有显著性差异。通过Westernblot法检测,结果显示,miR1271表达水平与其可能的靶向基因PDK1蛋白表达存在负相关性。结论在胰腺癌组织中,尤其是原发肿瘤组织中,miR1271表达降低,而PDK1基因及蛋白呈高表达状态。进一步通过生物信息数据库比对筛选,我们认为miR1271与PDK1的表达之间存在负相关,PDK1可能是miR1271调控的下游功能基因。第二部分miR1271通过下调IL-8相关肿瘤细胞事件抑制胰腺癌通过第一部分研究,我们发现了miR1271与其调控的下游基因PDK1在胰腺癌组织中的表达情况,并揭示了它们之间的相关性。由于既往研究认为PDK1与白介素表达有一定的相关性,而“炎-癌”转变是目前学界认为肿瘤发生发展的一个可能过程。白介素-8(IL-8)较高表达于多种肿瘤微环境中,是调控肿瘤的趋化因子CXC家族重要成员,于是我们第二部分研究拟通过炎症相关因子IL-8探索miR1271的抗胰腺癌作用。材料与方法人源胰腺癌细胞采用PANC1细胞系,购自美国菌种保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)。使用慢病毒转染构建IL-8敲除株(IL-8KD)和空载株,以及miR1271高表达转染质粒,通过PCR检测IL-8和miR1271表达水平证实转染是否成功。因此实验分为四组:分别为空白对照组(control),突变对照组(IL-8KD),空白干预组(miR1271)与突变干预组(IL8KD+miR1271)。进一步采用Westernblot法检测不同处理组PANC1细胞中的IL-8表达水平。分别使用MTT实验、Transwell实验、划痕试验及集落实验评估不同干预条件细胞株的肿瘤侵袭能力、迁移能力及细胞集落能力。结果经荧光定量实验证实,慢病毒干预后成功抑制胰腺癌细胞系的IL-8表达水平。Westernblot结果显示,与空白对照细胞株相比,miR1271处理显著降低了PANC1细胞的IL-8表达水平,且效果优于IL-8KD转染组。进一步通过PCR检测发现IL-8KD慢病毒处理虽然可以降低IL-8,但并不能影响miR1271表达。MTT实验说明实验组均能显著降低胰腺癌细胞活力,而以突变干预组最为显著。凝胶克隆实验、Transwell小室侵袭实验及划痕实验结果显示miR1271高表达可以抑制IL-8所致的胰腺癌细胞集落、侵袭及迁移能力。结论在胰腺癌中,炎症相关因子IL-8存在高表达现象,而miR1271可以抑制IL-8异常表达升高引起的胰腺癌肿瘤事件(包括增殖克隆、侵袭及迁移能力)。因此,IL-8可能是miR1271调控肿瘤炎症反应的重要下游因子。同时突变干预组的细胞系比单独转染miR1271质粒或敲除IL-8慢病毒的胰腺癌细胞系具有更明显的细胞抑制现象,说明还有更为复杂的信号通路/网络参与到miR1271抗胰腺癌作用中。第三部分miR1271经靶向调控PDK1下调AKT/MTOR信号通路的促胰腺癌凋亡作用经过前面部分的研究,我们得知了胰腺癌中miR1271和PDK1的表达情况及相互关系,在miR1271表达降低的同时,PDK1是高表达的,因此他们可能是负相关表达。而通过慢病毒转染干预和相关肿瘤细胞事件的研究,发现miR1271可能间接影响了IL-8异常高表达导致的胰腺癌细胞克隆增殖和侵袭转移的能力。而第二部分中突变干预组更明显的胰腺癌细胞抑制现象,提示我们miR1271的抗癌还有其它信号通路参与。基于KRAS基因是被上游PDK1调控的靶基因,且KRAS信号通路重要的一环是AKT/MTOR自噬通路。因此,第三部分研究拟通过PDK1这一靶向分子,探索miR1271在胰腺癌防治中的调控通路,其潜在机制或与AKT/MTOR信号通路相关。材料与方法PANC1细胞系(人源胰腺癌细胞系)同样购自购自美国菌种保藏中心。细胞干预方式包括顺铂梯度干预、靶向高表达miR1271质粒转染和miR1271抑制剂干预。采用Westernblot法检测凋亡标记物Caspase-3表达水平。MTT实验观察活细胞数量反映miR1271促调往情况。使用Westernblot检测样本或细胞中的PDK1蛋白及AKT/MTOR信号通路相关蛋白表达。使用ELISA与分别检测细胞株凋亡水平及细胞活力。构建荧光素酶标记细胞株验证PDK1与miR1271的调控关系。结果顺铂治疗升高了胰腺癌细胞系中miR1271表达水平,ELISA实验证实miR1271的高表达促胰腺癌细胞凋亡,且miR1271抑制肿瘤作用具有剂量依赖性。Westernblot验证了miR1271干预显著升高了Caspase-3的蛋白表达水平,MTT结果提示胰腺癌活细胞数量下降。而荧光素酶标记细胞株实验显示miR1271可以互补结合于PDK1基因序列,抑制PDK1转录。同时,Westernblot实验提示靶向敲除PDK1促胰腺癌细胞凋亡。miR1271可以通过靶向抑制PDK1降低AKT/MTOR信号通路AKT及MTOR磷酸化水平,阻碍通路激活,发挥抗胰腺癌作用。结论miR1271可以通过直接降低PDK1表达,靶向抑制AKT/MTOR激活,最终诱导胰腺癌细胞凋亡,即胰腺癌防治的miR1271—PDK1—AKT/MTOR信号通路。总结在胰腺癌中,miR1271低表达与PDK1高表达呈负相关性。高表达miR1271具有胰腺癌防治意义。miR1271可能通过间接调控炎症相关因子IL-8相关信号通路抑制胰腺癌。而miR1271与PDK1表达负相关,其通过直接降低PDK1基因的表达,靶向抑制下游自噬细胞通路AKT/MTOR激活,导致胰腺癌细胞的凋亡,即胰腺癌防治的miR1271—PDK1-AKT/MTOR信号通路。