新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是指围产期窒息导致脑的缺氧缺血性损伤,而出现的一系列中枢神经系统异常的表现,是新生儿期脑损伤的最常见原因,也是导致儿童发生严重神经系统后遗症的主要原因。目前HIE的发病机制研究虽然取得了很大进展,但是临床上对HIE仍然缺乏特效治疗方法。目前比较有前途的可用于治疗新生儿HIE的方法主要有三种:1)头部亚低温;2)干细胞移植;3)高压氧(hyperbaric oxygen,HBO)治疗。头部亚低温治疗新生儿HIE有一定近期疗效,但治疗窗较窄,一般要求在出生6小时内开始治疗,且对HIE的远期后遗症的改善效果不明显[Gluckman,2005],因此还难以在临床广泛推广。干细胞移植是指用某种外源性干细胞移植至体内,目前仍处于动物试验的基础研究阶段。而且存在着供体来源、宿主移植物排异和伦理道德等问题,使得其在临床上的应用受到限制。长期以来,人们认为中枢神经系统损伤后不能修复,但近年来在对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的研究中,人们发现在大脑的某些部位如侧脑室室管膜下(subventricular zone,SVZ)和海马DG区(hippocampal dentate gyrus,DG)终身存在着内源性的神经干细胞,在某些病理损伤的情况下,脑损伤可刺激体内生发区的神经干细胞增殖、分化,进行自我修复[Maslov,2004]。已经有文献报道,新生大鼠在缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)后脑内源性NSCs有增殖和分化现象[Hayashi,2005]。但是内源性干细胞不仅数量有限,而且受到神经营养因子缺乏、轴突生长抑制因子存在等影响因素,大脑的这种自身修复潜能有限,因此能够找到一种将大脑自身修复功能扩大的方法将为HIE治疗带来广阔的前景。HBO目前已经应用于新生儿HIE的治疗已有数十年历史。我国从上世纪90年代开始应用HBO治疗HIE以来,大部分文献报道均认为HBO可减轻患儿症状,降低病死率和伤残率[胡电,2004;盖勇,2005]。我们最近的研究也已证实,HBO不仅可促进缺氧缺血脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)新生大鼠内源性NSCs的增殖[余小河2006],并且还可促进增殖的内源性NSCs向损伤的大脑皮层迁移并分化为成熟的神经元[王晓莉,2008]。已有不少实验研究结果提示HBO治疗新生大鼠HIBD的有效时间窗为6～12 h。然而,临床上HBO治疗新生儿HIE一般要在生后1周左右开始,治疗2～3个疗程。有不少报道用这种方法治疗是有效疗的。为何HBO治疗的时间窗在实验研究与临床实践之间有较大的差异呢?其原因尚不清楚。为此我们提出假设,增加HBO的疗程可以延长其治疗的时间窗。那么,增加HBO的治疗时间或疗程后是否能够增强NSCs的增殖和分化呢?目前国内外的研究都只给1个疗程(5～7次),甚至1次的HBO治疗,尚未见到多疗程HBO对HIBD新生大鼠影响的文献报道。如果能够通过实验证实多疗程HBO能够延长治疗的时间窗,并提高疗效的话,这将为临床HBO治疗新生儿HIE的实施提供理论依据。本研究分为三部分:第一部分实验观察在常规的治疗时间窗(HIBD后2 h)开始多个疗程的HBO治疗对HIBD新生大鼠行为学和组织学的影响。研究结果显示了在HIBD后2 h给予1个疗程的HBO治疗即能够使神经元凋亡减少至接近正常,因此,即使再增加疗程也不再显示对神经元凋亡的抑制作用了。但是对HIBD新生大鼠行为学的改善却随着疗程的增加而增加。这一结果提示增加HBO的疗程可增强对行为学损害的保护作用,而这种保护作用的机制除了减少神经元凋亡以外,可能还存在着其它原因。根据我们最近的实验发现HBO治疗可促进HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖与分化[余小河,2004;王晓莉,2007:Yang YJ,2008],为此我们提出假设,增加HBO疗程能够增强对行为学损害的保护作用的机制与增强了促进内源性NSCs增殖与分化的作用有关。在这基础上设计了第二部分实验。第二部分实验观察了在常规的治疗时间窗(HIBD后2 h)开始多个疗程的HBO治疗对HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖与分化。实验结果证实了增加HBO疗程确实可增强HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖,并分化为神经元。有了这一结果,进一步我们就可以开始探讨延长HBO治疗时间窗后,是否可通过增加疗程来提高疗效。第三部分实验主要探讨在HIBD后48 h和96 h开始不同疗程的HBO治疗对HIBD新生大鼠有否保护作用。结果是肯定的,证明了即使是长达96 h的时间窗开始HBO治疗,通过增加疗程也可获得明显的保护作用。各部分的具体内容如下。一、不同疗程HBO对HIBD新生大鼠行为学及组织学的影响目的通过观察多疗程HBO治疗对HIBD新生大鼠脑部病变和远期行为学的影响,探讨增加HBO的疗程是否能够提高其疗效。方法7日龄Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为5组:1)正常对照组(CON,n=10),2)缺氧缺血脑损伤组(HIBD,n=10),3)高压氧1疗程组(HBO-1,n=10),4)高压氧2疗程组(HBO-2,n=10),5)高压氧3疗程组(HBO-3,n=10)。HIBD组按照Rice-Vannucci方法制作新生大鼠HIBD模型。高压氧治疗组在HIBD模型制成后2小时开始治疗,舱内压力2 ATA,稳压60 min,每日1次,7次为1个疗程。休息3天再进行下一个疗程。疗程结束后,各组均等到鼠龄35天时进行T迷宫试验、放射臂迷宫试验、足错误等行为学测试。测试完成后(鼠龄46天)处死动物,10%水合氯醛麻醉后打开胸腔,于心尖部插管注入生理盐水,待流出液清亮后,再注入4%多聚甲醛灌注固定,断头取脑,取出左侧大脑半球用4%多聚甲醛固定24h后石蜡包埋、固定、脱水后,切片机在前囟前1.0至-0.8mm冠状位连续切片,片厚4μm,行TUNEL法观察神经细胞凋亡和尼氏染色观察脑组织病理改变。结果(1)HBO组行为学测试结果优于HIBD组;(2)T迷宫测试中,随着天数的增加,正常组和HBO组的正确率逐渐增高;而且随着HBO疗程的增加,正确率逐渐增加,训练至第3天时,HBO-3组正确率明显高于HBO-1(P＜0.05)。(3)放射臂迷宫测试中,随着HBO疗程的增加,觅水时间逐渐减少,HB0-3组所需时间明显少于HBO-1和HBO-2组(P＜0.01);随着HBO疗程的增加,平均错误次数和重复次数逐渐减少,其中HBO-3组重复次数明显低于HBO-1和HBO-2组(P＜0.01)。(4)足错误测试中,HIBD组右左差值较对照组、HBO-2、HBO-3组高(P＜0.05),随着HBO疗程的增加,足错误次数减少。(4)TUNEL染色显示HBO治疗可抑制HIBD新生大鼠皮层神经元凋亡,但各疗程组之间差异无统计学意义。(5)尼氏染色显示HBO治疗可使皮层和海马CA1区神经元丢失较HIBD组显著减少,但各疗程组之间差异无统计学意义。结论(1)在短时间窗(2h)开始HBO治疗,对HIBD新生大鼠行为学损害的保护作用随着疗程增加而增加。(2)在短时间窗(2h)开始一个疗程HBO治疗,已经能够明显抑制神经细胞凋亡,增加疗程不再加强这一作用。二、不同疗程HBO对HIBD新生大鼠神经干细胞的增殖和分化的影响目的第一部分的研究结果显示了在HIBD后2 h给予1个疗程的HBO治疗即能够明显抑制神经元凋亡,再增加疗程已无法显示抗凋亡作用的继续增强。但是随着疗程的增加,HBO对HIBD新生大鼠远期行为学的改善更为明显。为此我们推测是否增加HBO的疗程可通过刺激内源性NSCs的增殖和分化来加强对行为学损伤的保护作用的。因此,本研究通过观察增加HBO疗程是否能够增强刺激HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖和分化。方法7日龄SD大鼠随机分为5组:1)正常对照组(CON,n=20),2)缺氧缺血脑损伤组(HIBD,n=20),3)高压氧1疗程组(HBO-1,n=20),4)高压氧2疗程组(HBO-2,n=20),5)高压氧3疗程组(HBO-3,n=20)。HIBD模型制作与HBO治疗方法同第一部分。每组各取10只动物在第三个疗程完成前48小时(即鼠龄33天时)腹腔注射BrdU(每次50 mg/kg,每8小时注射1次,连续5次)。各组动物均等到鼠龄35天时处死(方法同第一部分)取脑组织切片,采用BrdU/Nestin免疫荧光双标法检测缺血侧侧脑室室管膜下区(SVZ区)和海马齿状回(DG区)的内源性神经干细胞的变化;免疫荧光双标法检测大脑皮层BrdU/NSE和BrdU/GFAP阳性细胞数量。同时每组另外的10只动物用10%水合氯醛麻醉后断头处死,取缺血侧大脑半球全层脑组织约100mg,采用Western blot法检测缺血侧大脑半球nestin总蛋白的变化。结果1)HBO治疗后SVZ区BrdU~+/nestin~+细胞随疗程增加而增多,以HBO-3组的阳性细胞数最多,明显高于HIBD和HBO—1组(P＜0.01);2)各组大鼠的海马DG区均只有极少量的BrdU~+/nestin~+细胞表达,而且随着HBO疗程增加,BrdU~+/nestin~+细胞表达没有增加;3)大脑皮层BrdU~+/NSE~+细胞随着HBO疗程增加逐渐增多,其中以HBO-3组的阳性细胞数最多,高于HIBD和HBO-1组(P＜0.05);4)HIBD组可见较多GFAP~+细胞,而各疗程HBO治疗组GFAP~+细胞均明显减少;而且各组均只有少量BrdU~+/GFAP~+细胞;5)Western blot显示HBO-3组nestin蛋白表达高于HIBD、HBO-1和HBO-2组(P＜0.01)。结论HIBD后2小时给予HBO治疗,通过增加HBO疗程可促进HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖,并分化为神经元。三、增加HBO疗程对延迟治疗时间窗的新生大鼠HIBD疗效观察目的已有不少实验研究结果提示HBO治疗新生大鼠HIBD的有效时间窗为6～12 h。然而,临床上HBO治疗新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy.HIE)一般要在生后1周左右开始,治疗2～3个疗程。有不少报道用这种方法治疗是有效疗的。为何HBO治疗的时间窗在实验研究与临床实践之间有较大的差异原因不清楚。根据我们前面的研究结果,在HIBD后2小时开始给予一个疗程的HBO即可有效地抑制神经元凋亡的发生,对神经系统有保护作用。那么在时间窗延迟时,增加HBO疗程是否也能够对损伤的神经系统有保护作用呢?为此我们提出假设,增加HBO的疗程可以延长其治疗的时间窗。本研究旨在探讨多疗程的HBO治疗是否对96 h的时间窗的HIBD新生大鼠有保护作用。增加HBO疗程能够更好地减轻HIBD新生大鼠神经细胞的凋亡。方法7日龄SD大鼠(88只),随机分为11个组(n=8),包括正常对照组(CON)、缺氧缺血脑损伤组(HIBD)和高压氧组(HBO);HBO组根据HBO不同时间窗分为2h高压氧组(2H,在HIBD后2h开始给予HBO)、48h高压氧组(48H,HIBD后48h给予HBO)及96h高压氧组(96H,HIBD后96h给予HBO)等三个亚组;各亚组又根据不同疗程分成一疗程组(HBO-1)、二疗程(HBO—2)和三疗程组(HBO-3)等组。各组在HBO疗程完成后置于空气中喂养,待96H的三疗程组完成全部疗程后,即鼠龄38天(HIBD后31天)时一同处死,采用TUNEL染色检测各组大脑皮层和海马CA1区凋亡;并采用NSE免疫组化方法检测各组皮层神经元数量。结果(1)HIBD组凋亡细胞明显高于CON组,同时NSE阳性细胞明显少于CON组(P＜0.01);(2)随着时间窗的延长HBO对凋亡的抑制作用随之减弱,其中以96H组对凋亡的抑制作用最弱,但三个时间窗组与HIBD组比较,对凋亡的抑制作用差异均有显著意义(P＜0.01)。同时随着时间窗的延长,HBO对神经元的保护作用逐渐减弱,表现为NSE阳性细胞数量逐渐减少,但仍然多于HIBD组(P＜0.01);(3)HBO对神经细胞凋亡的抑制作用随着疗程的增多而增强;同时随着疗程增加,HBO对神经细胞的保护作用逐渐增强,NSE阳性细胞数量逐渐增多;但是2小时时间窗组(2H组)经过一疗程HBO治疗后,凋亡细胞数量已经减少至接近正常组,而且NSE阳性细胞数量的增加也接近正常组,因此随着疗程增加,不再显示抗凋亡和保护神经元作用的继续增强。结论(1)HIBD后2小时给予一疗程的HBO治疗即可明显抑制神经细胞的凋亡及保护神经元;(2)随着HBO开始治疗的时间窗的延迟,一个疗程的HBO对神经细胞凋亡的抑制作用逐渐减弱,但通过增加疗程可增强对神经细胞凋亡的抑制与对神经元的保护作用。综上所述,本研究结论如下:1、HIBD后2小时给予HBO可对HIBD新生大鼠的远期脑功能有修复作用。而且随着HBO疗程的增加,大鼠行为学改善的效果更为显著2、在HIBD后2小时给予HBO治疗,增加HBO的疗程可促进HIBD新生大鼠内源性神经干细胞的增殖,并分化为神经元。3、HIBD后2小时给予一疗程的HBO治疗即可明显抑制神经细胞的凋亡及保护神经元;随着HBO开始治疗的时间窗的延迟,通过增加疗程可增强抑制神经细胞凋亡的作用和对神经元的保护作用。