背景与目的:慢性牙周炎是一种在成年人中广泛流行的口腔感染性疾病。牙周炎发生时,大量的革兰阴性菌聚集于牙齿周围,导致牙龈组织炎症,牙周袋形成,大量细菌可以穿透上皮屏障进入深层结缔组织,进而导致牙槽骨丧失、牙齿松动脱落。具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum)是一种重要的牙周致病菌,其在慢性牙周炎发生发展过程中的作用尚未引起重视。研究表明,F nucleatum是一种特殊的拥有多种凝集素的厌氧菌,可以粘附于多种宿主细胞表面,如上皮细胞、成纤维细胞、多形核白细胞等。然而,F.nucleatum是否可以粘附于牙龈源性细胞并发挥作用尚不是很清楚。牙龈成纤维细胞(gingival fibroblasts,GFs)是构成牙龈结缔组织的主要细胞,在维持牙周组织稳定性及调控宿主炎症免疫反应过程中发挥重要作用。同时,牙龈组织中亦包含有少量的牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stem cells,GMSCs),在牙周组织修复过程中发挥至关重要的作用。然而F.nucleatum是否可以粘附并侵入GFs及GMSCs,并引起细胞生物学性状的改变,及其背后的生物学意义及分子学机制尚不是很清楚。目前,关于有效治疗F.nucleatum引起的感染性疾病药物的研发尚不是很充分。因此,本课题旨在研究不同浓度的F.nucleatum感染牙龈源性细胞不同时间后,GFs及GMSCs的生物学活性,如细胞增殖、迁移、分化、炎性因子及活性氧(reactive oxygen species,ROS)等的产生是否会发生变化,并对GFs及GMSCs在F.nucleantum作用后细胞内生物学性状发生改变的详细作用机制进行深入探讨;旨在通过对时序性F.nucleatum与GFs共培养后全部转录组基因表达变化进行深入挖掘,寻找能够抵抗F.nucleatum保护GFs的药物,为临床治疗炎症感染性疾病提供新的思路;旨在通过对时序性F nucleatum与GMSCs共培养后细胞内全部转录组基因表达变化进行分析,对F.nucleatum降低GMSCs成骨分化能力的分子机制进行了深入探讨,进而为指导炎症微环境中牙周组织再生策略的实施提供一定的思路。材料与方法:1.F.nucleatum与牙龈源性细胞的培养鉴定及共培养模型的构建F.nucleatum标准株ATCC 25586源于山东省口腔组织再生重点实验室,将保存菌种解冻后,于固体培养基中进行培养获得单菌落。挑取单菌落接种于液体培养基进行扩大培养。利用特异引物进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)实验以及16s rDNA测序法鉴定Fnucleatum的纯度。牙龈标本取自临床进行第三磨牙拔除术中获得的牙龈组织,将获得的牙龈组织一分为二,一份通过苏木素-伊红染色进行炎症状态检测,另一份则进行细胞分离培养。利用酶消化法获得大量GFs,并通过有限稀释法分离培养获得人GMSCs。利用结晶紫染色实验鉴定GMSCs克隆形成能力。利用流式细胞仪对GMSCs表面标志物CD29、CD44、CD45、CD73表达进行检测。搜集对数生长期的F.nucleatum,建立F.nucleatum 与 GFs(F nucleatum:GFs=10、50、100、200、400)及 GMSCs(F.nucleatum:GMSCs=10、50、100)共培养的细胞模型,并利用台盼蓝染色及结晶紫染色实验对共培养后细胞形态进行鉴定。2.F.nucleatum对GFs生物学活性的影响及机制研究首先创建感染复数(multiplicity of infection,MOI)为100的F.nucleatum与GFs共培养2h、6h、12h、24h、48h的细胞模型,各时间点均设置未与F.nucleatum共培养的正常生长GFs作为对照。利用高通量转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)技术对培养过程中细胞内全部转录组基因表达变化进行分析。寻找细菌感染细胞不同时间点后,细胞内持续发生变化的差异基因,并通过基因本体论(gene ontology,GO)与基因和基因组的京都百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)对筛选出的差异基因进行通路富集分析,明确与细胞增殖、凋亡、ROS及炎性因子产生相关的基因。构建F.nucleatum与GFs(MOI=10、50、100、200、400)共培养不同时间点的细胞模型。利用细胞计数实验及乙炔基脱氧尿苷(5’-ethynyl-2’-deoxyuridine,EDU)标签实验检测F.nucleatum对GFs增殖的影响。利用流式细胞仪分析方法对细菌感染后,细胞凋亡情况及ROS的产生进行检测。利用实时荧光定量聚合酶链反应(quantity real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)及酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对细菌感染后细胞内炎症因子IL-6、IL-8、IL-lβ、TNF-a等的表达进行检测。利用蛋白免疫印迹实验(western blot)及细胞免疫荧光技术对细菌感染后,细胞内NF-κB、MAPK、AKT等信号通路的激活进行检测。同时利用Pathview分析方法对时序性F.nucleatum作用后GFs内NF-κB、MAPK、AKT以及细胞凋亡等信号通路上所有基因表达变化进行了检测,并利用PCR技术对部分差异基因的表达进行了验证。3.保护GFs抵抗F.nucleatum药物的筛选及作用机制研究基于时序性F.nucleatum感染GFs后产生的所有差异基因(differentially expressed genes,DEGs),我们通过GO及KEGG数据库对差异基因进行功能富集分析。利用cogena分析方法对所有差异基因进行聚类分析并从美国食品药品监督管理局(food and drug administration,FDA)批准的所有临床上市药物中筛选能够逆转各基因簇内差异基因表达量的药物。明确靶向各类基因簇内基因的药物并筛选部分代表性药物,对其保护效果进行验证。通过检测药物预处理后再与F.nucleatum共培养GFs内ROS的产生及NF-ΚB、MAPK、AKT等信号通路的激活情况来验证药物抵抗F.nucleatum,保护GFs的作用效果。4.F.nucleatum对GMSCs生物学活性的影响及机制研究构建GMSCs与F.nucleatum(MOI=10、50、100)共同培养24h、48h、72h(3d)、7d、14d、21d、28d的体外模型。利用流式细胞仪分析方法检测与F.nucleatum共培养后,GMSCs表面标志物CD29、CD44、CD73的表达是否会变化。利用细胞计数实验及EDU标签实验检测F.nucleatum对GMSCs增殖的影响。利用Transwell实验检测F.nucleatum对GMSCs迁移的影响。利用qRT-PCR及ELISA实验对F.nucleatum感染后GMSCs内趋化因子及炎性因子的基因及蛋白表达水平进行分析。同时,我们通过检测GMSCs内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、矿化结节形成、成骨相关基因及蛋白的表达来评估F nucleatum感染后GMSCs的成骨分化能力是否会发生改变。为了研究F.nucleatum影响GMSCs成骨分化的作用机制,我们利用高通量RNA-seq技术对F.nucleatum与GMSCs共培养3d、7d、14d、21d后细胞内全部基因表达变化进行分析,寻找F.nucleatum与GMSCs共培养各时间点产生的特异差异基因,利用GO与Reactome数据库对各个时间点所产生的特异性差异基因以及所有时间点产生的共同差异基因进行功能富集分析。此外,通过GO生物学过程筛选出各个时间点与细胞分化相关的差异基因,并利用GO、疾病本体(disease ontology,DO)、KEGG及DisGeNET数据库对其进行功能富集分析。5.F.nucleatum对GMSCs成骨分化过程中肿瘤相关基因表达的研究基于F.nucleatum(MOI=100)与GMSCs共培养3d、7d、14d、2Id后的转录组数据,我们利用微阵列分析方法(microarray significantprofiles,maSigPro)寻找时序性差异共表达基因,并利用GO及KEGG数据库对其功能进行分析。将所获得的差异共表达基因与比较基因与毒性数据库(comparative toxicogenomics database,CTD)中所有肿瘤基因取交集进行分析,获得F.nucleatum与GMSCs相互作用后产生的肿瘤相关基因,并利用qRT-PCR实验对其表达量进行验证。利用时序性分析方法(short time-series expression miner,STEM)明确正常生长的GMSCs(对照组)及与F.nucleatum共培养的GMSCs(实验组)内具有显著差异的动态变化基因集,并对各个显著基因集内的基因进行功能相似性分析及通路富集分析。对差异共表达基因及实验组中的动态变化基因进行交集分析,获得动态的差异共表达基因。基于筛选出的动态差异共表达基因,利用GeneMANIA数据库构建功能富集网络图。利用相关数据库对调控动态差异共表达基因的相关转录因子(transcription factor,TFs)及微小核糖核酸(microRNA,miRNA)进行预测,最终通过cytoscape软件构建TFs-mRNAs-microRNA的整合网络。结果:1.F.nucleatum标准株的培养鉴定、GFs与GMSCs的分离培养鉴定及共培养模型的构建F nucleatum在固体的脑心浸液培养基(brain heart infusion,BHI)上呈现为扁平的、边缘暗淡的、中央凸起的半透明菌落。PCR实验及16s rDNA测序结果表明F nucleatum表达特异片段。单菌落在100 mL液体培养基中生长,对数生长期出现在接种后18h到30h。原代培养的GFs及GMSCs呈现明显的成纤维细胞形态。台盼蓝染色实验结果表明,低浓度的F.nucleatu(MOI=10、50、100)能粘附于GFs表面,对细胞形态改变无明显影响;高浓度的F.nucleatum(MO1=200、400)能促使GFs由长梭形向圆形转变。结晶紫染色实验结果表明F.nucleatum(MOI=10、50、100)与GMSCs共培养,对细胞形态改变无明显影响。2.F.nucleatum通过激活AKT/MAPK及NF-κB信号通路促进GFs凋亡、ROS与炎性因子产生GFs与不同浓度F.nucleatum(MOI=10、50、100、200、400)共培养不同时间后,细胞内基因表达水平及生物学活性发生了急剧变化。RNA-seq结果显示,F.nuclematu能时间依赖性的增加GFs内差异基因数目。F.nucleatum感染细胞2h、6h、12h、24h、48h,与各时间点对照组基因表达量相比,在所有时间点均具有显著差异的基因有62个,GO与KEGG富集分析结果表明这些基因显著的富集到了TNF-α、IL-17、NF-κB等信号通路上。细胞计数实验结果表明,F.nucleamtum以剂量依赖性及时间依赖性的方式抑制细胞的增殖。EDU标签实验结果表明高浓度的F.nucleamtu感染细胞24h,显著地降低细胞增殖率。GO富集分析结果表明CCL2、SOD2、NFKBIA等基因在F.nucleatum感染后的5个不同时间点显著上调,在参与调控细胞的增殖过程中发挥重要作用。流式细胞仪分析结果显示高浓度的F.nucleatum显著促进GFs凋亡及细胞内ROS产生。SOD2在F.nucleaatum感染下显著上调,在调控细胞凋亡与ROS产生过程中发挥重要作用。qRT-PCR结果显示F nucleatum在与GFs共培养早期能激活细胞表面Toll样受体(toll-like receptor,TLR)-2、TLR4的表达,促进细胞内炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α等的产生。ELISA结果显示F.nucleaatum感染能促进GFs炎症因子IL-6及IL-8的释放,但对IL-1β、TNF-α蛋白的产生无影响。Western blot实验结果表明F.nucleatum通过增加p-p65、p-IκBα、p-AKT、p-p38、p-ERK、p-JNK的蛋白水平来激活NF-κB、MAPK、AKT信号通路。细胞免疫荧光实验结果表明,F.nucleatum通过促进p65及p-p65蛋白从细胞质向细胞核内转位来激活NF-κB信号通路。Pathview分析结果表明F.nucleatum感染细胞2h到48h,显著的改变了NF-κB、MAPK、AKT及细胞凋亡信号通路上的基因表达,激活下游基因Bcl-2、COX-2、A20、IκBα、MIP2等表达,进而发挥抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、ROS产生及炎性因子释放等生物学作用。3.药物重定位法对抵抗F.nucleamtu、保护GFs药物的筛选及作用机制研究GFs与F.nucleatu(MOI=10、50、100、200、400)共培养2h、6h、12h、24h、48h后,产生了971个共表达的差异基因(fold change,FC≥4)。Cogena分析结果表明这些差异基因显著的分为3簇,第一簇基因于F nuclematu感染细胞12h后即显著上调,第二簇基因于F nucleatum感染细胞2h后显著上调,第三簇基因于F nuclematu感染细胞12h后显著下调。GO及KEGG功能富集分析结果表明F.nucleatum感染细胞2h后即发生变化的差异基因显著的富集到了细胞因子受体、NOD样受体等免疫相关通路上,而F.nucleamtu感染细胞12h后发生明显变化的差异基因显著的富集到了 TGF-β信号通路等代谢相关通路上。进一步,我们利用基于cogena的药物重定位分析方法从FDA批准的药物列表中筛选出了能够逆转各类基因簇内基因表达变化的药物。对筛选出的6种药物etravirine、zalcitabine、wortmannin、calcium D-pantothenate、ellipticine、tanespimycin 发挥抵抗 F.nucleaatum、保护GFs的作用机制进行了深入研究。利用荧光酶标仪对药物预处理后再与F.nucleatum共培养24h后GFs内ROS的产生及NF-κB、MAPK、AKT信号通路的激活进行检测,结果表明这些药物可以通过部分阻断AKT、MAPK信号通路来抑制F.nucleamtu诱导的GFs内ROS的产生,进而发挥保护GFs的作用。4.F.nucleatum促进GMSCs趋化因子及炎性因子释放、抑制GMSCs增殖及成骨分化人GMSCs扩大培养到第4代时仍能表现出较高的生长活性。F.nucleatum与GMSCs共培养对干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73的表达无影响。细胞计数实验结果表明F nucleaatum剂量依赖性的抑制GMSCs增殖。Transwell实验结果表明,F.nucleatum(MOI=50、100)能显著促进GMSCs的迁移。qRT-PCR结果表明F.nucleatum能显著的提高GMSCs内趋化因子CCL2、CCL5、CCL20及CXCL1、CXCL2、CXCL3的表达。此外,F.nucleatum能显著的提高PTGS2、SOD2、CSF2、IL-6、IL-8、IL-1β的基因表达水平。ELISA结果显示F.nucleatum能促进炎性因子IL-6、IL-8的释放,但对IL-1β蛋白的表达没有影响。F.nucleatum能通过降低GMSCs内ALP活性及抑制细胞内矿化结节的形成来降低GMSCs的成骨分化能力。qRT-PCR实验结果表明F.nucleatum能显著的降低GMSCs内成骨分化相关基因ONC、ALP、Runx2、OCW、BSP和OPN的表达。Western blot实验结果表明F.nucleatum能显著的降低GMSCs内成骨相关蛋白ALP、COL1、BMP2、Runx2、Osterix和BSP的表达。RNA-seq研究表明F.nucleatum与GMSCs共培养3d、7d、14d、21d分别产生258、323、591、245个差异基因,所有时间点共有的差异基因有8个。Reactome富集分析结果表明,F.nucleatum与GMSCs共培养3d后,相对于正常生长的GMSCs有149个独特的差异基因产生,这些差异基因显著富集到干扰素相关信号通路上;F.nucleatum与GMSCs共培养7d后,相对于正常生长的GMSCs有140个独特的差异基因产生,这些差异基因显著富集到细胞外基质改建、胶原合成以及酶调控等信号通路上;F nucleatum与GMSCs共培养14d后,相对于正常生长的GMSCs有292个独特的差异基因产生,这些差异基因显著富集到IL-10、IL-4、IL-13等信号通路上;Fnucleatum与GMSCs共培养21d后,相对于正常生长的GMSCs有84个独特的差异基因产生,这些差异基因显著富集到视网膜脂质受体与G蛋白偶连受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)相关信号通路上。通过GO数据库筛选出与细胞分化相关的差异基因共64个,包括Bcl2、IL-6、TGFβ2等。GO富集分析表明这些细胞分化相关的基因显著富集到细胞因子活性、细胞表面构成、细胞外基质改建等通路上。DO、KEGG与DisGeNET富集分析结果表明这些细胞分化相关基因在调控骨癌、甲状腺癌、结肠癌等疾病的发生发展过程中发挥重要作用。转录组学分析结果提示在定向诱导GMSCs成骨分化过程中,持续的F.nucleamtu感染有促进干细胞向肿瘤细胞方向分化的风险。5.F.nucleatum促进GMSCs成骨分化过程中肿瘤相关基因的表达F nucleatum与GMSCs共培养的时序性转录组学研究表明,,F.nucleatum抑制GMSCs成骨分化并促进细胞内肿瘤相关基因表达。F nucleatum在与成骨诱导基中的GMSCs共培养3d、7d、14d、21d时,有790个时序性差异共表达基因产生。其中,包括50个肿瘤相关基因。F nucleatum与GMSCs共培养产生了5个动态差异共表达基因,分别是磷脂酶C2(phospholipase C gamma 2,PLCG2)、软骨几丁质酶 3 样蛋白 2(cartilage chitinase 3-like protein 2,CHI3L2)、L3MBTL4、SH2D2A和NLRP3。GeneMANIA数据库分析表明PLCG2、CHI3L2、SH2D2A和NLRP3和其它20个相互作用的基因构成了复杂的调控网络,这些基因显著的富集到了癌症相关信号通路上。基于这5个动态差异共表达基因我们获得了43个相关的转录调控因子(transcription factors,TFs)及 50 个 microRNA,并构建了TFs-mRNAs-microRN A 整合网络。结论:1.成功从人牙龈组织中分离培养获得了纯化的GFs及GMSCs。成功构建了F.nucleatum.与GFs及GMSCs共培养的体外模型。2.F.nucleatum通过激活AKT/MAPK及NF-κB信号通路抑制GFs增殖,促进GFs凋亡、ROS及炎性细胞因子产生。3.药物重定位法可以作为一种新型的方式来筛选临床上市药物进而辅助临床抗菌治疗研究。Etravirine、zalcitabine、wortmannin、calcium D-pantothenate、ellipticine、tanespimycin能通过抑制F nucleatum诱导的GFs内ROS的产生来发挥保护GFs的作用。4.F.nucleatum能抑制GMSCs增殖及成骨分化能力,促进GMSCs趋化因子及炎性因子释放。转录组学研究表明F nuclematu在调控GMSCs成骨分化过程中产生的细胞分化相关差异基因显著富集到了癌症相关信号通路上。5.F.nucleatum能促进GMSCs成骨分化过程中肿瘤相关基因的表达。F.nucleamtu显著性的改变了动态差异基因PLCG2、CHI3L2、L3MBTL4、SH2D2A、NLRP3的表达变化。这5个基因受到了43个TFs(如CREB3、GATA2、SOX4)及50个microRNA(如miR-372-3p、miR-603、miR-495-3p)的调控。