肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)在泌尿系统中是最为常见的恶性肿瘤之一,它的生物学活动极其复杂多变,发生发展及转移的分子机制至今仍不明确。近年来的研究发现微小RNA-99a(mi R-99a)在舌鳞状细胞癌、浆膜卵巢癌、肝癌、鳞状细胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌及儿童肾上腺皮质肿瘤等多种肿瘤中的表达水平均下调,并且对这些肿瘤的生长有明显的抑制作用,预示着mi R-99a可能作为潜在的肿瘤抑制因子用于肿瘤的诊断与治疗。基于目前尚未有mi R-99a在肾癌中的研究报道,本研究在肾癌组织标本及肾癌细胞中检测mi R-99a的表达水平,分析mi R-99a表达与预后的相关性,通过体外及体内实验研究mi R-99a对肾癌细胞功能及肿瘤进展的影响,检测相关信号通路,进一步探讨可能的作用机制,以期给肾癌的诊断和治疗带来新的思路。第一部分mi R-99a在肾癌中的表达及临床意义目的:探讨肾癌细胞系、肾癌组织及相应癌旁组织中mi R-99a的表达,并分析与临床特征的关系,探讨肾细胞癌患者的临床预后的关系。方法:采用实时定量逆转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT–PCR)检测肾小管上皮细胞株HK-2、肾癌细胞株786-0、肾癌细胞株OS-RC-2以及40例肾癌组织和相应癌旁组织的mi R-99a的表达水平,并对其进行比较和相关分析。结果:q RT-PCR结果显示786-0及OS-RC-2中mi R-99a表达明显低于HK-2,相对于癌旁组织,肾癌标本中mi R-99a表达明显下调。Kaplan-Meier分析显示,mi R-99a表达水平降低的患者生存期显著缩短。结论:mi R-99a在肾癌组织和细胞中明显低表达,mi R-99a表达水平下降的患者生存期明显缩短,提示mi R-99a可能成为肾癌诊断及预后的新标志物。第二部分mi R-99a对肾癌细胞功能及肿瘤进展的影响目的:通过细胞功能实验及裸鼠成瘤模型研究mi R-99a对肾癌细胞功能及肿瘤进展的影响。方法:应用合成的mi R-99a模拟物转染786-0及OS-RC-2,采用细胞增值检测、克隆形成检测、迁移检测、侵袭检测、流式细胞检测,观察上调mi R-99a表达对肾癌细胞功能及细胞周期的影响。裸鼠皮下注射786-0成瘤后再次注射mi R-99a模拟物,mi R-99a结果:细胞功能实验表明转染mi R-99a模拟物可对肾癌细胞的增殖、存活、迁移、侵袭起到抑制作用,并诱导细胞周期G1期的阻滞,动物实验显示注射mi R-99a模拟物后肿瘤生长明显受抑制。结论:mi R-99a高表达可明显抑制肾癌细胞功能及肿瘤进展,提示mi R-99a可能成为治疗肾癌的有效调节靶点。第三部分mi R-99a调控肾癌进展相关信号通路的机制研究目的:检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)及其通路下游相关因子在肾细胞癌中受到mi R-99a调控后的表达情况,进一步探讨mi R-99a通过m TOR信号通路抑制肿瘤进展的机制。方法:通过生物信息搜索mi R-99a的靶基因。在HK-2、786-0及OS-RC-2中检测m TOR的表达情况。mi R-99a模拟物转染786-0及OS-RC-2,检测m TOR的表达水平变化。裸鼠皮下注射786-0成瘤后再次注射mi R-99a模拟物,检测肿瘤组织中m TOR的表达水平变化。mi R-99a的靶基因通过荧光素酶活性实验验证。mi R-99a模拟物转染786-0,检测m TOR信号通路相关因子及下调细胞周期相关蛋白的表达水平变化。m TOR-si RNA转染786-0,采用细胞增值检测、克隆形成检测、迁移检测、侵袭检测、流式细胞检测,观察下调m TOR对肾癌细胞功能及细胞周期的影响。结果:生物信息搜索提示m TOR是mi R-99a的靶基因,m TOR在肾癌细胞中的表达明显高于HK-2,肾癌细胞及动物模型中上调mi R-99a后m TOR表达明显下调,荧光素酶活性实验证实m TOR是mi R-99a的靶基因。mi R-99a模拟物转染786-0后m TOR信号通路相关因子及细胞周期相关蛋白均表达下调,m TOR-si RNA转染786-0可抑制肾癌细胞增殖、存活,并阻滞细胞周期G1期,而细胞迁移及侵袭不受抑制。结论:m TOR是mi R-99a的靶基因,mi R-99a可直接通过m TOR信号通路来诱导细胞周期G1期的阻滞,下调m TOR可部分拟表型肾癌细胞中上调mi R-99a的功能改变,提示mi R-99a可能并非完全通过m TOR信号通路抑制肾癌进展。