鲍曼不动杆菌越来越多的被认为是导致医院获得性或医源性感染最重要的病原菌之一。该病原体可引起诸多部位的感染,包括呼吸道、血液、皮肤和软组织感染甚至是异物相关性感染,并且这些感染在重症监护病房表现的更为突出。由于鲍曼不动杆菌对部分抗菌药物天然耐药并且拥有强大的获得耐药的能力,使得临床上对其治疗有效的方案十分有限。随着多重耐药菌在世界范围内的不断蔓延,临床上出现了仅仅对替加环素和多粘菌素敏感的泛耐药菌株,而这两种抗菌药物被认为是治疗耐药菌感染的最后方案。目前大量证据认为多粘菌素E是治疗鲍曼不动杆菌感染的中坚力量,但由于其独特的药代动力学/药效学特性使得该药在临床上常需要与其他抗菌药物联合应用。另一方面,新型抗菌药物的研发速度缓慢导致临床医师不得不联合应用现有的抗菌药物以期待获得更好的协同杀菌效应。但到目前为止,能够达到理想治疗效果的具体联合用药方案尚不明确。因此,寻找有效治疗耐药菌感染的新策略已成为我们当务之急的研究目标。本实验对鲍曼不动杆菌的耐药现状进行分析,并利用蜡螟感染模型初步探讨新的联合治疗方案。主要研究分为如下两个部分进行:第一部分安徽地区临床分离的鲍曼不动杆菌的分布及耐药性分析目的:了解安徽地区鲍曼不动杆菌的临床分布及耐药情况,为有效预防和控制医院感染、指导临床合理用药提供理论依据。方法:981株鲍曼不动杆菌临床分离株来自安徽省细菌耐药监测中心2010年-2013年每年9月份收集的35家医院的住院部和门诊患者的各类临床标本。大肠埃希菌ATCC25922作为药敏试验的质控菌保存于安徽省细菌耐药监测中心。采用琼脂倍比稀释法进行包括多粘菌素E在内的17种抗菌药物的药敏试验。结果采用美国临床微生物标准委员会建议的标准进行判读。采用微量肉汤稀释法对替加环素的最低抑菌浓度进行测定,结果参照美国食品药品监督局的建议进行判读。采用WHONET 5.6软件对鲍曼不动杆菌的来源情况和耐药率及其变化进行统计分析。结果:981株鲍曼不动杆菌临床分离株中有73.3%(719/981)分离自痰标本,16.2%(159/981)分离自引流液和脓液,有6.0%(59/981)的菌株分离自血液样本。从科室分布看,来源最多的是重症监护病房(46.7%),其次为呼吸科(12.3%)和神经外科(10.6%)。占70%以上的鲍曼不动杆菌对三种以上的抗菌药物耐药。此次收集的鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物包括哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、亚胺培南以及美洛培南的耐药率均超过了40%;对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率为20%以上,但其中介率也高达20%以上,且耐药率呈逐年上升趋势;对米诺环素的耐药率在30%左右;仅替加环素及多粘菌素E对其仍保持较高的敏感率(>90%)。结论:鲍曼不动杆菌主要来源于引起下呼吸道感染的重症医学病房的患者。药物敏感性试验显示鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物的耐药性仍然十分严峻。因此,有必要加强细菌耐药监测以指导临床合理应用抗菌药物。第二部分多粘菌素E联合万古霉素治疗鲍曼不动杆菌感染的体内外研究目的:评价多粘菌素E联合万古霉素在体外及在蜡螟感染模型中对鲍曼不动杆菌的抗菌活性,从而验证这种治疗方案是否能够用于泛重耐药菌的治疗。材料与方法:采用琼脂倍比稀释法测定包括多粘菌素E和万古霉素等9种抗菌药物对鲍曼不动杆菌标准株ATCC19606和临床菌株GN2231的最低抑菌浓度。利用蜡螟幼虫建立鲍曼不动杆菌感染模型以进一步研究抗菌药物的体内抗菌活性。测定感染灭活细菌或活菌的蜡螟幼虫的致死率,同时考察幼虫接种细菌后环境温度对其生存率的影响。观察抗菌药物对蜡螟感染幼虫的保护作用,并测定幼虫体内细菌载量的变化。采用标准棋盘法在含有MH肉汤的微量孔平板中测定多粘菌素E联合万古霉素的协同效应。绘制多粘菌素E单用或联合万古霉素时对两株鲍曼不动杆菌的时间杀菌曲线。进一步在蜡螟感染模型中评估多粘菌素E和万古霉素单用或联合使用时的抗菌活性。蜡螟幼虫接种致死剂量的鲍曼不动杆菌ATCC19606或GN2231,接种两小时后给予同等于人体治疗剂量的多粘菌素E和/或万古霉素。未感染的幼虫和经PBS治疗的幼虫作为对照组,每24小时观察一次,连续观察4天。结果:感染活菌的载量和蜡螟幼虫的生存率负相关,并且其生存率随着培养温度的增高而降低。在体外实验中敏感的抗菌药物能有效提高蜡螟幼虫的生存率。棋盘法显示多粘菌素E联合万古霉素在体外表现为协同效应(FIC<0.5)。时间杀菌曲线也显示临床治疗浓度万古霉素和多粘菌素E联合使用时对两株鲍曼不动杆菌均表现出快速而持久的杀菌活性。多粘菌素E联合万古霉素使用时较单药治疗更能提高感染致死剂量的蜡螟幼虫的生存率。结论:蜡螟感染模型可以替代哺乳动物模型或在进入临床研究之前用于鲍曼不动杆菌感染与治疗的相关研究。尽管需要更多的动物实验和临床试验,但本研究中的体内外实验证实多粘菌素E联合万古霉素是一种可以有效治疗多重耐药鲍曼不动杆菌感染的潜在的方案。第三部分:多粘菌素E联合万古霉素防止鲍曼不动杆菌耐药突变的体外研究目的:在琼脂平板及肉汤中验证多粘菌素E对鲍曼不动杆菌的耐药突变选择窗(mutant selection window,MSW)理论。进一步评价多粘菌素E联合万古霉素防止鲍曼不动杆菌耐药突变的能力。材料与方法:为描绘多粘菌素E药物浓度对鲍曼不动杆菌ATCC19606的恢复生长曲线,将细菌均匀接种于系列浓度的含药平板上,培养24h后计数平板上恢复生长的细菌数量。采用修正的时间杀菌曲线评估多粘菌素E对鲍曼不动杆菌ATCC19606的高载量杀菌活性。将待测菌(~1010CFU/ml)加入含有系列药物浓度(0.5×,4×,16×,64×,128×MIC)的MH肉汤中,35℃培养。分别在0,4,8,12,24和48 h从锥形瓶中吸取100μl培养液进行平板计数。并于实验结束时检测肉汤中的耐药菌。通过琼脂平板法检测多粘菌素E单药及联合万古霉素对30株临床收集的泛耐药鲍曼不动杆菌的防耐药突变浓度(mutant prevention concentration,MPC)。结合临床药代动力学评价联合方案防止鲍曼不动杆菌耐药突变的能力。结果:多粘菌素E药物浓度对鲍曼不动杆菌ATCC19606的恢复生长曲线中存在一位于MIC和MPC之间的平台期;在体外时间杀菌曲线显示多粘菌素表现出较快的杀菌能力。当肉汤中的药物浓度位于4×,16×,64×MIC时,鲍曼不动杆菌在12h后都出现了快速的恢复生长。杀菌实验结束时,在这些浓度组的培养液中均发现了伴有MIC显著增高的突变菌。但这种由耐药突变导致的恢复生长现象并没有在最低浓度组(0.5×MIC)和最高浓度组(128×MIC)出现。30株泛耐药鲍曼不动杆菌的MIC值均<4μg/m L,而其MPC值范围为64~>512μg/m L,MPC50为256μg/m L,MPC90为>512μg/m L。联合万古霉素后MPC值范围降低为16~>512μg/m L,MPC50和MPC90分别为128μg/m L和>512μg/m L。结论:多粘菌素E对鲍曼不动杆菌符合MSW理论;临床建议的多粘菌素给药方案使得药物浓度落入MSW以内;联合万古霉素可以一定程度上降低多粘菌素E的MPC值,但仍无法避免诱导耐药的发生。