在农业生产和生物医学研究中,体细胞核移植都有着极其重要的应用,但是,克隆效率低下一直阻碍着体细胞核移植的进一步应用和发展。核移植的技术步骤较为复杂,很多相关的研究也一直围绕核移植操作流程中的受体卵母细胞的去核方法、融合过程、激活过程以及早期胚胎体外培养体系等方面进行了探讨。然而,由于克隆胚胎发育率的多变性和胎儿发育效率的低下性,除了从核移植的操作流程方面去探讨和改良外,同时还应该从生产重构胚胎的生物材料——即供体细胞和受体卵母细胞的来源、质量及表观遗传状态等——对于重编程的影响及二者之间的相互作用进行探讨和研究。本研究首先优化了牛卵母细胞体外成熟培养体系。本实验对比了四种不同的激素配比对牛卵母细胞体外成熟的作用,结果显示添加人尿促性腺激素(HMG)的成熟实验结果稳定,17β-雌二醇(E2)对牛卵母细胞成熟有一定的促进作用,HMG+E2联合使用可以得到高效稳定的成熟结果;在此基础上,比较了表皮生长因子(EGF)对牛卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育的影响,结果表明在成熟液中添加30 ng/ml EGF对牛卵母细胞的成熟质量、胚胎发育及降低胚胎细胞凋亡都有明显的促进作用。本研究最终确定的牛卵母细胞体外成熟培养液为:TCM-199中添加0.075 IU/ml HMG,1μg/ml E2,30 ng/ml EGF,10%(v/v)FBS。接下来本研究对比了血清饥饿法与接触抑制法在调整供体细胞周期中对核移植效果产生的作用。结果发现,虽然两种方法在重构胚的融合率、卵裂率和囊胚发育率上并无太大的差异,二者均可以得到较好的结果;但是血清饥饿处理会引起胚胎凋亡率增加,导致核移植胚胎质量下降。细胞的传代会对核移植结果产生影响,以第2-5代细胞的效果最好,但当传代次数过多后则会造成重构胚发育能力的下降;也会引起核移植囊胚凋亡率上升。根据以上结果,本研究在后续实验中均使用接触抑制法处理的第2-5代细胞为供体细胞。随后,本研究分别应用未成熟卵母细胞抽提物、成熟卵母细胞抽提物和孤雌激活的卵母细胞抽提物预处理供体细胞,通过对比处理细胞的全能性基因表达和脱乙酰化程度检测三种胞质抽提物对供体细胞的重编程效果。随后进行核移植实验,以正常核移植胚胎为对照比较了来自于三组不同抽提物预处理供体细胞的重构胚的体外发育情况和囊胚质量,从而分析牛卵胞质抽提物对供体细胞的重编程作用对体细胞核移植的影响。结果如下,三组胞质抽提物都能有效的重编程供体细胞;在三组抽提物中,成熟卵胞质抽提物使得供体核的表观遗传状态与受体胞质更为接近,因此对克隆胚胎发育率和囊胚质量有显著的促进作用。这些结果表明,用牛卵胞质抽提物预处理供体细胞能提高重构胚体外发育能力,相对于将供体核重编程到一个更低的分化状态,将供体核重编程到一个与受体胞质相一致的状态更有利于克隆胚胎的发育。本研究设计使用小鼠和牛两种在基因表达调控和发育程序上有着巨大差异的物种研究早期胚胎中供体核与胞质在指导发育上的作用,构建了小鼠-牛异种克隆胚胎,检测了异种胚胎的体外发育时间、胚胎形态、合子激活基因的表达情况,结果表明异种克隆胚胎在合子基因激活(ZGA)前的发育是由牛的卵胞质控制的,在发育时序和胚胎形态上都表现出牛胚胎的特性,同时小鼠的合子基因激活也受到牛卵胞质的作用而在8-细胞期才得以表达,并且激活是不完全的。小鼠的合子基因激活受到牛卵胞质的影响而延迟和不完全激活是造成小鼠-牛异种克隆胚阻滞在8-细胞期的一个原因。最后,本研究设计使用38.5℃正常培养的孤雌激活胚胎与41℃培养7 h的热激孤雌激活胚胎进行核质置换,分别构建热激核-正常胞质重构胚以及热激胞质-正常核重构胚,检测了核质置换胚胎的体外发育率、合子激活基因的表达和胚胎凋亡情况,以研究早期胚胎核与胞质对热激的应激反应,以及产生应激后二者之间的相互作用。结果如下,当正常核移入热激的卵胞质,重构胚的发育率显著下降;热激后的核质置换胚胎中存在合子基因激活不完全的现象,这种情况主要存在于热激胞质-正常核重构胚中;热激能诱导胚胎发生细胞凋亡,早期胚胎的胞质对热激更敏感并在后期的诱导凋亡中起到主导作用。这些结果表明,虽然热激对核和胞质都有损伤,但胞质对热激损伤更为敏感。早期胚胎受到热激后导致发育能力降低的易感性主要是由于胞质所引起的;早期胚胎受到热激可能会损伤到卵胞质中的母源因子,即使与正常核构成重构胚也依然会导致合子基因表达异常;并且胞质受到热激损伤会在热激诱导的凋亡机制中起到比核更大的作用。