烟草(Nicotiana tabacum L.)是世界上重要的经济作物和模式作物之一,具有较高的经济价值和科研价值。目前,烤烟烘烤以及烟叶原料难以满足卷烟工业需求的问题仍然较为突出。变黄期是烘烤过程中烟叶生理生化变化最为关键的步骤之一,对烟叶品质的形成至关重要。因此,本文利用蛋白质组学等技术研究变黄期优质烟叶形成的重要生物学过程及分子调控机制。主要研究结果如下:1、利用iTRAQ技术对烤烟高温烘烤过程中关键点(鲜烟叶、38℃和42℃)的蛋白质组进行了定量分析,共鉴定出8903个可靠蛋白质和2034个丰度(表达)差异蛋白质(上调1150个和下调1074个)。烟叶变黄期丰度差异的蛋白质主要涉及翻译后修饰/蛋白质折叠、分子伴侣、一般功能预测、碳水化合物运输与代谢、能量生产与转化、翻译/核糖体结构与生物发生、氨基酸运输与代谢等。另外,光合作用、核糖体、代谢、碳代谢、光合作用天线蛋白质和次生代谢的生物合成通路是最显著的主要富集通路。烘烤中高温胁迫主要通过下调光合作用代谢通路和降解细胞成分来维持细胞活力和养分循环,从而加速烟叶衰老。糖和能量代谢相关的生物学过程和代谢通路可能是烘烤高温下烟叶衰老过程中的关键调节因子。2、利用iTRAQ质谱技术从变黄期烟叶(0 h、48 h、72 h)中共鉴定出5931个蛋白质,不同比较组(48 h vs 0 h、72 h vs 0 h、72 h vs 48 h)分别具有674个、724个和95个丰度差异蛋白质。为了阐明变黄期烟叶质体色素代谢和颜色变化的分子机制,筛选了19个与类胡萝卜素代谢有关的丰度差异蛋白质和12个与叶绿素代谢相关的丰度差异蛋白质。采用全二维气相色谱-飞行时间质谱联用技术鉴定了82种香气挥发性成分,其中类胡萝卜素降解产物19种,叶绿素降解产物1种。类胡萝卜素和叶绿素降解产物总量0-48 h降低,48-72 h增加。这些丰度差异蛋白质对类胡萝卜素代谢具有复杂的调控作用,对叶绿素生物合成具有负调控作用,对叶绿素降解具有正调控作用,从而延缓了类胡萝卜素(叶黄素)的降解,加速了叶绿素的降解,促进了叶片黄色的形成。其中,叶绿素酶(Chlase-1-X2)的上调表达可能是叶绿素代谢和颜色变化的关键蛋白质分子调控机制。3、利用TMT蛋白质组技术和质谱技术研究了烟叶在烘烤过程中的凋萎(发软/软化)机制。结果表明,烘烤过程中烟叶水分含量、柔软度值、细胞壁物质含量均呈现降低的趋势,但不同烘烤工艺条件下(H1,相对低湿处理/75%相对湿度;H2,中等湿度处理/85%相对湿度;H3,相对高湿度处理/95%相对湿度)烟叶水分含量、柔软度值差异较为显著,细胞壁物质含量差异相对较小。不同湿度处理,相对中湿条件下烟叶的柔软度变化居中,细胞壁物质降解量相对较多。相关分析表明,相比细胞壁物质,烘烤过程中烟叶水分含量与柔软度值的关系更密切。烟叶样品中共检测到11556个蛋白质,其中不同样品共有496个丰度差异蛋白质。为了阐明烟叶凋萎机理,筛选了27个与细胞壁代谢相关的丰度差异蛋白质。其中,果胶乙酰酯酶、葡聚糖内切-1,3-β-葡萄糖苷酶、木葡聚糖内转葡糖苷酶/水解酶、α-木糖苷酶1-like蛋白质、预测的半乳糖醇-蔗糖半乳糖基转移酶、内切几丁质酶A、壳三糖酶-1-like蛋白质和细胞壁扩展蛋白质是烟叶采后凋萎的关键蛋白质。这些差异蛋白质主要参与果胶代谢、纤维素和半纤维素代谢、半乳糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢以及细胞壁扩张。因此,脱水和细胞壁代谢是不同烘烤条件下烟叶凋萎的关键。4、利用类靶标代谢组学技术研究了不同烘烤工艺条件下(H1、H2、H3)变黄期烟叶代谢物质的变化,共鉴定和定量480个代谢物,其中大部分差异代谢物在不同的比较组中(H3-72h vs H2-72h除外)显著下调。差异代谢物富集分析表明,氰氨基酸代谢、氨酰tRNA生物合成、苯丙氨酸代谢、氨基酸的生物合成代谢是多个比较组中显著富集的4条代谢途径。其中,6种氨基酸关键差异代谢物质在多个代谢途径中显著富集,即L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、缬氨酸。另外,共鉴定和定量19种氨基酸和45种氨基酸及其衍生物。不同烘烤工艺条件下,H2处理氨基酸及其衍生物含量平均值最低。另外,2-羟基-D-谷氨酸和L-高胱氨酸可以作为变黄期烟叶代谢状态的分子标志物。总之,变黄期烘烤工艺处理及氨基酸代谢对烟叶品质的形成具有重要的影响。5、对不同湿度烘烤工艺处理(H1、H2、H3)不同比较组差异蛋白质和差异代谢物之间的相关性进行分析,结果表明:比较组H1-72h vs H0、H2-72h vs H0、H3-72h vs H0、H2-72h vs H1-72h和H3-72h vs H1-72h大部分差异蛋白质与差异代谢物呈正相关,即差异蛋白质与差异代谢物表现出调控的一致性,而比较组H3-72h vs H2-72h大部分差异蛋白质和代谢物之间呈负相关,即差异蛋白质与差异代谢物表现出调控的非一致性。变黄期烟叶样品中有3个通路在3个比较组H1-72h vs H0、H2-72h vs H0和H3-72h vs H0中富集,即代谢通路、硫胺素代谢通路以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路。比较组H2-72h vs H1-72h、H3-72h vs H1-72h、H3-72h vs H2-72h只有代谢通路在3个比较组中富集。综合来看,差异蛋白质和差异代谢物在代谢通路中的复杂调控是变黄期烟叶品质形成的重要途径。综上所述,烘烤变黄期是采后烟叶烟叶品质形成的关键阶段,利用蛋白质组学等技术从烟叶衰老、色素代谢与颜色调控、凋萎(发软)、氨基酸代谢等关键的生物学过程方面探讨了烟叶品质形成的调控机制,为提升烟叶的黄、软、香品质奠定了坚实的基础。