论文部分内容阅读
脆性X综合征(Fragile X syndrome, FraX)是最常见的遗传性智力低下疾病之一。临床表现多样,主要表现为中到重度的智力低下,常伴有巨睾、特殊面容、多动症、癫痫发作,大量患者脑电图存在特征性弥漫性瞬间慢波发放等临床病理表现。超过99%的FraX是由位于Xq27.3的脆性X智力低下基因1(fragile X mental retardation 1,FMR1)5′端非编码区(CGG)n三核苷酸重复序列的异常扩增及CpG岛的异常甲基化引起FMR1编码产物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)的表达下降或缺失所导致。分别定位于3q28及17p13.1的脆性X相关基因1/2(fragile X related gene 1/2,FXR1/2)被发现与FMR1具有高度的序列及结构相似性,三者统称为脆性X基因家族(FXR gene family)。其编码的蛋白不仅可以与自身结合形成同源二聚体,也可与家族中其他蛋白结合以异源二聚体形式存在。FXR1P系列相互作用蛋白的筛选以及验证将在一定程度上有助于了解FXR1P的调节机制及其基本功能,进而明确FXR1P与脆性X综合征发病机制的关系。本研究利用酵母双杂交技术研究FXR1P相互作用蛋白,首先构建酵母双杂交系统诱饵质粒pGBKT7-FXR1,并将其转化酵母菌AH109,与转化了Matchmaker人胎脑pGADT7-cDNA文库质粒的酵母菌Y187进行配合(Mating),通过一系列报告基因的表达检测筛选阳性克隆,将经酶切鉴定后阳性克隆质粒AD/Library转化酵母菌Y187,再与诱饵质粒pGBKT7-FXR1酵母菌进行一对一小交配验证蛋白质的相互作用,真阳性克隆的AD/Library质粒测序及生物信息学分析,共得到了七种可能与FXR1P相互作用的蛋白:Btf,SAFB,CMAS,FTH1,CSH1,GOLGA4,HSD17B1;对其中的两种与凋亡相关的蛋白(Btf和SAFB)进行了免疫共沉淀实验,构建真核表达载体pCMV-FXR1-Myc,pCMV-Flag-FXR1, pCMV-Btf-Myc, pCMV-SAFB-Myc,哺乳动物细胞内的免疫共沉淀验证FXR1P与Btf、SAFB的相互作用,结果表明FXR1P能够与Btf相互作用,而与SAFB的相互作用免疫共沉淀未检测到。根据实验结果提示Btf是FXR1P蛋白调控网络的新成员,在神经、肌肉等组织生长发育过程中发挥一定的作用。FXR1P可能参与细胞凋亡的发生过程。