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白细胞介素-7(interleukin-7,IL-7)是一种多潜能的细胞因子,能促进B和T淋巴细胞生存、分化和增殖,在T细胞稳态调节中起关键作用,且能诱导CTL和巨噬细胞的细胞毒活性,因此,IL-7对T细胞耗竭的病人(如癌症、骨髓移植及AIDS)有非常好的治疗潜能。近年来人们在不同的肿瘤组织中发现了分子大小不同的IL-7剪接变异体(如IL-7-δ4、IL-7-δ4/5、IL-7-δ3/4等),推测其可能参与调节IL-7的生物活性。因此,本课题利用原核表达系统表达、复性和纯化重组人IL-7(recombinanthuman IL-7,rhIL-7)及其剪接变异体蛋白(rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4),并利用免疫印迹技术对其进行鉴定,为其生物活性研究打下基础。研究目的:本课题在已经成功构建IL-7及其剪接变异体的原核表达载体pET21b-IL-7、pET21b-IL-7-δ4、pET21b-IL-7-δ4/5和pET21b-IL-7-δ3/4的基础上,表达、复性和纯化rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5和rhIL-7-δ3/4蛋白,为其生物活性研究打下基础。研究方法:⒈rhIL-7及其剪接变异体蛋白的表达:对各保种菌重新进行PCR鉴定和测序鉴定后,测定生长曲线,以确定最佳IPTG诱导时机,并对各重组蛋白进行诱导表达和可溶性分析,优化IPTG诱导浓度和诱导时间,以确定最佳表达参数,SDS-PAGE分析表达产物。⒉rhIL-7及其剪接变异体蛋白的复性:各重组蛋白以包涵体形式表达后,通过梯度透析的方法复性,复性液A、B、C、D、E中分别含4、3、2、1、0M盐酸胍(Gu-HCl),并在复性关键步骤中加入L-精氨酸(L-Arg)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽(GSH)等复性辅助试剂以提高复性效率,采用BCA法测定蛋白液复性前后的浓度以计算各蛋白的复性效率。⒊rhIL-7及其剪接变异体蛋白的纯化和Western Blot鉴定:采用Ni2+亲和层析色谱法纯化各重组蛋白,上样后经Binding Buffer(30mM咪唑)洗脱非特异性结合的杂蛋白,再分别用Elution BufferA(60mM咪唑)、B(100mM咪唑)、C(300mM咪唑)进行梯度洗脱,分阶段收集洗脱液,SDS-PAGE、BandScan软件分析各蛋白纯度,BCA法测定纯化后的各蛋白浓度。分别以6×His小鼠单克隆抗体和鼠抗人IL-7抗体为一抗,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG为二抗对纯化后的各重组蛋白进行Western Blot鉴定。结果:⒈rhIL-7及其剪接变异体蛋白的表达:PCR扩增出的片段大小与预期的IL-7(531bp)、IL-7-δ4(399bp)、IL-7-δ4/5(345bp)、IL-7-δ3/4(318bp)一致,且测序结果与已报道的序列一致。rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白均能在大肠杆菌BL21(DE3)中获得良好表达,分别在17.4kDa、12.4kDa、10.3kDa、9.3kDa附近有一明显的条带,且均为包涵体形式表达。生长曲线分析和表达条件优化结果显示,rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白最佳诱导时机分别为:37℃、180rpm培养1.5h、2h、2.3h、1.8h;其最佳表达条件分别为(37℃、180rpm条件下培养):1.0mM IPTG诱导2h、0.4mM IPTG诱导2h、0.6mM IPTG诱导3h、0.8mM IPTG诱导2h。⒉rhIL-7及其剪接变异体蛋白的复性:rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白的复性效率均较好,分别约为50%、48%、45%、65%,且该复性方法重复性良好,可用于各重组蛋白的大量制备。⒊rhIL-7及其剪接变异体蛋白的纯化和Western Blot鉴定:SDS-PAGE、BandScan软件分析显示,各重组蛋白的纯化效果较好,其纯度均达到了95%以上,BCA法测定其纯化后的浓度均约为0.1mg/mL。以6×His小鼠单克隆抗体为一抗的Western Blot鉴定结果显示,rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4分别在17.4kDa、12.4kDa、10.3kDa、9.3kDa附近出现条带;以鼠抗人IL-7抗体为一抗的Western Blot鉴定结果显示,rhIL-7、rhIL-7-δ4分别在17.4kDa、12.4kDa附近出现条带,而rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4分别在10.3kDa、9.3kDa处没有条带;Western Blot鉴定结果与预期结果相符,表明各重组蛋白均获得有效表达。结论:本研究采用原核表达系统表达rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白,确定了最佳表达参数;经SDS-PAGE分析显示,各重组蛋白均为包涵体形式表达,经梯度透析法复性后,各重组蛋白的复性效率均较好,分别约为50%、48%、45%、65%;采用Ni2+亲和层析色谱法纯化后,各重组蛋白的纯化效果较好,其纯度均达到了95%以上,BCA法测定其纯化后的浓度均约为0.1mg/mL;经Western Blot鉴定结果显示,各重组蛋白均获得有效表达。因此,成功获得了高纯度的rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4复性蛋白,且该技术方法稳定性较好,有利于各重组蛋白的大量制备,为其生物活性研究打下了物质基础。