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目的:1、选用高效液相色谱法以 kaempferol、myricetrin、quercitrin、myricetin、quercetin、hinokiflavone、amentoflavone这七种黄酮类成分为指标,对POL黄酮类化合物进行研究,确定POL的高效液相色谱法含量测定方法。2、利用所建立的POL黄酮类化合物HPLC测定法,测定POL、炮制后的POL等样品的含量,对比POL经过炮制后与未经过炮制的样品中myricetrin等7个黄酮成分的变化。3、采用紫外检测双泵液相色谱法(HPLC),测定贵州贵阳等产地POL中天冬氨酸等18个AA的含量,研究炮制加工对POL天冬氨酸等18个成分的影响,为POL进一步的质量评价标准提供具有参考价值的研究基础。4、确立紫外比色法测定POL中以quercetin为指标黄酮类成分的测定方法,并比较用不同提取方式提取POL中总黄酮的含量多少。并依据此法,研究POL中黄酮类化合物的最适合的提取工艺。5、观察POL中黄酮类化合物解热、抗炎、镇痛、抑菌等方面的药理作用。材料与方法:1、液相柱为月旭极致(长效碳18,5微米,250mm),样品洗脱液为甲醇-水(0.2%phosphoric acid)色谱柱程序清洗,紫外测定波长330nm,样品洗脱液速度1mL/min。2、根据药典(通则0213)照炒法、照炒炭法进行POL炮制。3、选择色谱柱前衍生化处理HPLC,并使用AA系统程序分析仪,来测定样品中的多种AA;样品洗脱液为乙腈-水(1:1):4%乙酸钠缓冲盐,样品洗脱液速度为1.2mL/min,进行色谱柱程序清洗,紫外测定波长为360nm,柱温箱温度为27℃。4、采用紫外分光光度法测定,用石油醚脱脂并用75%乙醇萃取、直接用75%乙醇萃取、水提醇沉至醇浓度50%、水提醇沉至醇浓度70%,以quercetin为指标,采用氯化铝比色法,在423nm下测定吸光度。5、用黄酮类化合物总量以及quercitrin的提取率为复合指标,采用四因素三水平的正交试验,研究了提取溶剂、萃取次数、提取时间和固液比四种因素对POL总黄酮提取率的影响。确定POL最好的提取工艺过程。6、利用所建立的制备工艺提取POL总黄酮,并利用2,4二硝基苯酚致大鼠发热法研究其解热作用;用二甲苯和蛋清诱导炎症法观察其抗炎效果;用小鼠热板法观察它是否具有镇痛效果;采用体外抑菌法观察其是否具有抑菌效果。结 果:1、对照品 myricetin、kaempferol、quercetin、myricetrin、amentoflavone、hinokiflavone、quercitrin的标准曲线相关系数≥0.9995,说明线性关系良好,平均回收率和相对标准偏差均符合相关要求(n=6)。2、炮制加工后,POL 中 myricetrin、quercitrin、hinokiflavone 及 amentoflavone 含量降低,而myricetin、quercetin及kaempferol含量相对升高。3、在不同产地,POL均含有18种AA,其中包含8种人体必需AA,以河北产地的POL中必需AA所占比例为最高,而总AA含量最高的则来自于安徽。加工后18种AA含量全都下降,并且随着炮制程度的加深AA含量明显下降。4、醇沉工艺中醇沉浓度为70%所得的浸膏中黄酮含量最多。5、提取工艺最佳提取条件是微波时间90s,甲醇浓度为70%,料液比1:40。6、POL药材中黄酮类化合物对热刺激所引起的疼痛反应、2,4二硝基苯酚致大鼠发热法、蛋清和二甲苯引起的炎症反应具有明显的抑制作用;体外抑菌实验的结果表明,POL所含有的黄酮类成分能够抑制金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌等菌株。结论:1、本实验建立的POL中myricetrin等7个黄酮对照品HPLC方法相对简单,回收率等方法学考察相关实验数据结果显示均符合要求,在POL和POL的炮制品测定当中应用可得到理想的效果。2、POL炮制前与炮制后所含的myricetrin等七个黄酮成分其种类和含量都有所改变,由于黄酮类化合物基本母核一致或者相近,其种类和含量的改变推测炮制过程对POL存在着成分的转化过程。3、利用POL中AA的含量作为指标来评价药材质量具有一定的意义。炮制前后AA的含量差别明显,且炮制后AA含量显著下降,可考虑不经炮制直接入药。4、所建立的氯化铝比色法稳定可靠,能够准确测定POL中以quercetin为指标的POL黄酮类成分的含量。5、四因素三水平正交实验所确定的提取方法,工艺合理可行、步骤简单实用,它是POL中黄酮类化合物的最优提取方法。6、实验数据充分证明POL中黄酮类成分具有较好的抗炎、解热、抑菌、镇痛作用。