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近年来引起仔猪腹泻的肠道冠状病毒给养猪业造成巨大的经济损失,其中猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是主要的病原,引起仔猪严重的腹泻、呕吐、脱水和高死亡率,其疫苗防治是目前的研究热点。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis,B.subtilis)是一种常用的益生菌,可以用作抗原递送载体和黏膜免疫增强剂,能够引起机体保护性免疫反应。为了研制高效、安全和方便操作的口服免疫活载体疫苗,首先,本研究构建了表面展示表达TGEVS全长蛋白的重组枯草芽孢杆菌(B.subtilisCotGSG),串联表达PEDVS蛋白和M细胞靶向蛋白的重组枯草芽孢杆菌(B.subtilis RCL)。其次,通过仔猪体内试验验证了 B.subtilis CotGSG芽孢口服免疫对肠道黏膜免疫和全身系统免疫应答水平的影响。再次,应用仔猪肠道原位结扎灌注模型和分离猪骨髓源树突状细胞(Dendritic cells,DCs)技术,研究了B.su tilis芽孢通过仔猪肠道黏膜下DCs诱导高效黏膜免疫反应的机理。最后,探讨了靶向肠道M细胞的B.subtilisRCL进一步增强B.subtili 黏膜免疫载体的递送效率。本研究内容具体分为以下4个部分:1表达TGEVS蛋白的重组枯草芽孢杆菌的构建本试验中首先设计以B.subtilis解淀粉酶E基因(amyE)为整合同源臂、硫酸卡那霉素(Kan)为抗性基因的重组表达载体骨架pInAmyE,将amyE5’、amyE3’和Kan基因分别PCR扩增后连入线性化的pCDNA3.1(+)质粒中,得到pInAmyE质粒。随后PCR分别扩增B.sub ilis芽孢被膜蛋白G基因(CotG)、TGEV S全长蛋白基因和绿色荧光蛋白基因(GFP),并用同源重组的方式将三个基因片段进行连接,连入线性化的pInAmyE质粒中,得到重组表达载体pInCotGSG。通过对电击转化的方法进行探索,确定了 一套稳定的转化条件。并将pInCotGSG质粒转化进入B.subtilis WB800菌株中,获得重组枯草芽孢杆菌B.subtilis CotGSG。经过基因组PCR验证发现TGEV S蛋白基因整合进入B.subtilis WB800基因组中。最后通过Western-blot验证和共聚焦显微镜观察,结果表明TGEVS蛋白可以在重组枯草芽孢杆菌B.subtilis CotGSG芽孢表面表达。为接下来进行的口服重组表达TGEVS蛋白的枯草茅孢杆菌的试验奠定基础。2 口服表达TGEVS蛋白的重组枯草芽孢杆菌对仔猪免疫功能的研究本试验运用第一章转化获得的重组枯草芽孢杆菌(B.subtilis CotGSG)口服免疫一月龄仔猪,首先通过检测粪便中特异性SIgA抗体水平和小肠黏膜淋巴细胞数量研究仔猪消化道局部黏膜免疫水平。其次,通过检测血清特异性IgG及中和抗体水平评价口服疫苗对全身系统免疫水平的影响。结果发现,B.subtilis CotGSG茅孢口服免疫仔猪7天后,就可诱导肠道中显著的TGEV特异性SIgA抗体分泌,免疫35天后还能显著的增加肠道中的上皮内淋巴细胞(IELs)和CD3+T淋巴细胞的数量。这说明B.subtilisCotGSG芽孢能诱导肠道局部黏膜免疫应答。在体液免疫水平的检测中发现口服免疫B.subtilis CotGSG芽孢后仔猪后,血清中TGEV特异性IgG抗体和中和抗体效价均出现明显升高,并且在免疫中期显著高于口服灭活TGEV组。由以上结果可知,表达TGEV S蛋白的重组枯草芽孢杆菌芽孢口服免疫仔猪后,能够刺激机体产生TGEV特异性的体液和细胞免疫反应,并且一定程度上可以抵抗TGEV的感染。3枯草芽孢杆菌诱导黏膜免疫机理的探究有效的黏膜免疫反应首先需要免疫递呈细胞对抗原摄取、加工和递呈。肠道黏膜下广泛分布着树突状细胞(DCs),DCs摄取微生物抗原是启动黏膜免疫的第一步,DCs加工处理抗原后将抗原呈递给上皮下淋巴细胞或者迁移至附近的淋巴组织,进一步活化初始T、B淋巴细胞,诱导免疫反应。首先,本研究在仔猪肠道原位结扎灌注模型中,观察肠道DCs对B.subtilis芽孢的摄取能力,以及携带B.subtilis芽孢的DCs向附近淋巴结迁移的情况;其次在体外试验中,分离猪骨髓源树突状细胞与B.subtilis芽孢进行孵育,探究B.subtilis茅孢对猪骨髓源树突状细胞的刺激成熟能力以及进一步对T细胞增殖的影响。通过共聚焦显微镜观察和流式检测发现,DCs能有效的摄取肠腔中的B.subtilis芽孢,进一步迁移至肠系膜淋巴结中,并且还能上调肠道CCL20 mRNA表达;B.subtilis芽孢能刺激DCs成熟,进一步促进T细胞的增殖分化。以上结果表明,B.subtilis CotGSG芽孢通过刺激肠上皮细胞分泌CCL20募集DCs至肠黏膜下,DCs摄取B.subtilis CotGSG芽孢后对其进行加工处理,同时迁移至肠系膜淋巴结中激活T细胞并促进T细胞增殖,这可能是B.subtilisCotGSG芽孢引起下游有效的特异性免疫应答反应的一个重要机制。4靶向M细胞增强枯草芽孢杆菌黏膜免疫递送效率的探究肠道M细胞是一种特化的肠上皮细胞,能够有效的递呈抗原给下方的DCs、巨噬细胞和T、B淋巴细胞等免疫细胞,进一步诱导特异性免疫反应。因此本研究为了增强B.subtilis免疫递送效果,首先,构建了串联表达能够靶向M细胞(L-Lectin-β-GF蛋白)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的重组枯草芽孢杆菌(B.subtilis RCL)。其次,通过小鼠肠道原位结扎灌注试验探究B.subtilis RCL与肠道M细胞的共定位情况以及通过小鼠口服免疫试验探究M细胞增殖情况、肠道涮洗液中PEDV特异性SIgA抗体水平和血清中特异性IgG抗体水平。结果发现,口服B.subtilis能够有效的诱导小鼠肠道M细胞增加以及非特异性SIgA抗体增加。B.subtilisRCL能够与肠道M细胞出现明显的共定位现象,并且一段时间后能有效的进入淋巴组织中。口服免疫小鼠后,B.subtilis RCL可诱导显著的肠道PEDV特异性SIgA抗体和血清中IgG抗体分泌,并且能够增强肠道PEDV特异性SIgA抗体水平。由以上结果可知,B.subtilisRCL能通过M细胞增强肠道局部黏膜免疫应答和诱导有效的全身性免疫反应。为增强枯草芽孢杆菌黏膜免疫递送效率的研究提供了一定的理论依据。