研究背景和目的炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是一种慢性反复发作的肠道炎症性疾病,以反复发作的腹痛、腹泻、便血为主要的临床症状。根据发病机制、病理类型等方面的差异,IBD又可分为溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）及克罗恩病（Crohn’s disease,CD）。IBD病程迁延,给患者的工作和生活带来了极大的负面影响,也给社会增加了巨大的医疗卫生负担。关于IBD的发病机制,目前有多个假说,主流观点认为遗传、饮食、肠道菌群及社会心理因素均在IBD的发生发展中发挥了重要作用。既往IBD的研究显示其主要发病地区在以欧美为代表的发达国家,但近年来,亚洲尤其是以中国为代表的东亚国家发病率呈现快速上升的趋势。这些国家有一个非常明显的特点是社会经济快速发展的同时,人群中普遍存在焦虑和抑郁等负面情绪。而既往研究证实,焦虑等负面心理因素可以增加炎症性肠病的发病风险,此外焦虑也是IBD患者最常见的心理共患病,这部分患者病情进展更凶险,治疗效果更差,住院时间更长。HPA轴的激活是焦虑情绪下机体反应的主要标志之一,而既往研究显示,IBD患者及动物模型中糖皮质激素（人类为皮质醇,小鼠为皮质酮）水平明显升高,并且与疾病活动程度明显相关。目前焦虑对于IBD发生发展的作用尚不明确。据此,本研究致力于明确UC患者焦虑水平与疾病活动程度的关系,并明确HPA轴过度激活对结肠炎的影响。研究方法:1.临床信息统计及分析（1）纳入山东大学附属齐鲁医院消化内科病房及内镜室确诊的UC患者,收集患者年龄、性别、是否伴有高血压、糖尿病等系统性疾病、既往治疗方式等基础信息。（2）通过问诊,访问门诊及住院电子病历系统收集患者排便次数、便血情况、内镜下黏膜表现以及既往治疗方案和治疗效果等主要信息,并由患者既往就诊的IBD医师对该患者总体情况进行评分,最后使用Mayo评分标准,判断患者疾病活动程度并进行分级。（3）在向患者充分解释测试内容后,使用SAS焦虑自测量表对患者焦虑情况进行评估。由患者在安静环境中独立进行答题,答题结束后将各项分数汇总,得到SAS原始分,原始分乘以1.25后四舍五入取整数为标准分,根据标准分对患者焦虑情况进行分级。（4）结果使用GraphPad Prism 5.0c软件统计,单变量分析人口统计学特征采用χ2检验。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。两组比较采用Student’s t检验或Manne-Whitney非参数检验。两个参数之间的相关性采用Spearman秩相关法。结果以平均值±标准差（Mean±SD）表示。p＜0.05被认为有显著性差异。2.动物模型的构建（1）HPA轴激活模型的构建使用束缚应激诱导焦虑模型来模拟HPA轴过度激活的状态,实验组小鼠在每天固定时间段被放置在顶端开口的50ml离心管内,保证其头端正对顶端开口,水平放置在鼠笼内3小时,连续进行7天。（2）肠炎模型的构建使用1%的戊巴比妥钠溶液按50mg/Kg剂量腹腔注射诱导麻醉,镇静后分别给予对照组和束缚应激组小鼠1%的OXA（50%乙醇溶解）100ul/只进行灌肠,并保持头端向下垂直竖起20分钟,期间使用加热垫进行保温。20分钟后将小鼠水平放置在鼠笼内,保持鼠笼温度。（3）使用酶联免疫吸附实验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测束缚应激对小鼠血清皮质酮水平的影响,评估小鼠HPA轴活动度,并根据小鼠诱导肠炎后的体重变化、结肠长度、组织病理学评分以及炎症因子及肠道屏障蛋白表达水平等指标评估焦虑模型小鼠及对照组小鼠肠道炎症水平。研究结果:1.共有79名年龄在18～71岁之间的患者被纳入研究。男性41名（51.9%）,女性38名（48.1%）,病变局限于直肠的患者6名（7.6%）,累及左半结肠的有24名（30.4%）,全结肠型患者有49名（62%）。79名患者中有6名患者为初发型,其余患者均为慢性复发型,63名患者接受过至少一种生物制剂治疗。2.根据临床症状、内镜下表现及相关IBD医师对病情的评估对每个患者进行Mayo评分,评分显示,缓解期患者11名,活动期患者68名,其中Mayo评分为轻度活动的患者有19名,中度活动的患者有31名,重度活动的患者有18名。根据每个患者SAS标准分评估患者焦虑情况:75.9%的患者有轻度及以上的焦虑症状,19名患者无焦虑,10名患者有轻度焦虑,27名患者有中度焦虑,23名患者有重度焦虑。处于缓解期的UC患者焦虑发生率约为27.2%,且都为轻度焦虑。疾病活动期的UC患者焦虑发生率约为83.8%,轻度焦虑占12.3%,中度焦虑占42.1%,重度焦虑45.6%。3.无焦虑的患者中缓解期占42.1%,轻度活动占47.4%,中度活动占5.3%,重度活动占5.3%;轻度焦虑的患者中,缓解期患者占20%,轻度活动期占33.3%,中度活动占40%,重度活动占6.7%;中度焦虑的患者中无缓解期患者,轻度活动期占11.5%,中度活动占65.4%,重度活动占23.1%;重度焦虑患者中无缓解期患者,轻度活动期占10.5%,中度活动占36.8%,重度活动占52.6%。对患者SAS评分及疾病活动程度Mayo评分进行相关性分析示SAS评分与Mayo评分呈显著正相关。4.在30名糖皮质激素治疗效果不佳的患者中,SAS评分大于等于50分的占90%,在糖皮质激素治疗效果尚可的人群中,这一比例为66.7%。在SAS评分大于等于50分的患者中,糖皮质激素治疗效果不佳的患者比例为38.5%,在SAS评分小于50的患者中这一比例为18.8%。对SAS大于等于50分的患者进行分层分析后,激素治疗效果不佳在在轻度焦虑患者中的比例为20%,在中度焦虑患者中为52.2%,重度焦虑患者中为68.4%。5.与对照组小鼠相比,模型组小鼠血清皮质酮水平更高,并且在诱导肠炎后体重损失更多、结肠长度更短、病理评分更高、炎症因子水平更高而紧密连接蛋白表达水平下降。研究结论:1.大约75.9%的UC患者存在焦虑症状,并且活动期UC患者焦虑发生率明显高于缓解期患者。2.患者焦虑评分与疾病活动度评分呈显著正相关,焦虑评分更高的患者疾病活动程度越高,糖皮质激素治疗效果不佳的概率越大。3.模型小鼠HPA轴明显激活,并且在诱导结肠炎后肠道炎症程度更重。研究背景及目的:下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA axis）作为在机体遭受压力应激等刺激时的神经内分泌调控核心,在机体处于焦虑等负面情绪时会出现过度激活的情况。皮质醇（小鼠体内为皮质酮）又被称为“stress hormones”,被认为是HPA轴激活的标志,可以在压力应激等条件下调节机体代谢、免疫细胞功能以适应外部环境的改变。但有研究证实,异常激活的HPA轴会导致皮质醇的过量分泌,从而造成机体稳态失衡,加剧病理进程。炎症性肠病患者血清及唾液中皮质醇含量明显升高并且升高水平与疾病活动程度正相关;此外在动物实验中,给予小鼠地塞米松腹腔注射以模拟皮质酮升高会促进化学诱导肠炎的加重。这些都提示异常激活的HPA轴在炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）的发生发展中起到了重要作用。虽然有研究提示焦虑情况下的HPA轴过度激活会导致肠上皮屏障通透性增加,但也有研究未观察到这种现象,因此HPA轴过度激活加重肠道炎症的机制尚不明确。既往研究证实UC患者存在Ⅱ型免疫过度激活的特点,患者黏膜及血清中IL-5/IL-13等Ⅱ型细胞因子水平相较于正常人群明显上升,此外黏膜组织IL-13水平更高的患者往往病情进展更迅速,治疗效果不佳,预后更差。除了适应性免疫,固有淋巴细胞（innate lymphoid cells,ILC）也是维持机体稳态的重要组成部分,其中2型固有淋巴细胞（group 2 innate lymphoid cells,ILC2）主要分布在肺、肠道等黏膜组织器官内,其表达特异性的转录因子GATA3并可以持续分泌IL-5、IL-13等Ⅱ型细胞因子,在恶唑酮（Oxazolone,OXA）诱导的Ⅱ型免疫依赖的肠炎模型中发现ILC2的过度激活已可以加剧肠道炎症。同时,糖皮质激素已经被证实可以促进机体产生更多的Ⅱ型细胞因子。因此,本研究推测焦虑可能是通过HPA轴过度激活导致的激素紊乱引起包括Th2以及ILC2等免疫细胞功能异常而促进了肠炎的发生和进展。研究方法:1.使用束缚应激的方法构建焦虑模型,并分析束缚应激模型小鼠结肠固有层淋巴细胞比例及功能变化。实验组小鼠进行连续7天的束缚应激处理,7天后处死对照组及实验组小鼠,使用密度梯度离心法提取小鼠结肠固有层淋巴细胞（Lamina propria lymphocytes,LPL）,通过流式细胞学技术（Flow Cytometry,FACS）评估束缚应激对小鼠固有层各类免疫细胞亚群比例及功能的影响。2.使用地塞米松（Dexamethasone,DXMS,5mg/Kg）腹腔注射模拟焦虑引起的HPA轴激活状态,连续注射7天,7天后处死小鼠,提取小鼠结肠LPL,FACS评估DXMS注射后小鼠结肠各种免疫细胞的比例及功能变化。3.给予小鼠OXA诱导肠炎,评估HPA轴激活模拟组（DXMS注射）小鼠肠炎水平。连续7天腹腔注射后,分别给予对照组和DXMS注射组小鼠1%OXA100ul/只灌肠,并保持头端向下垂直竖起20分钟,期间使用加热垫进行保温。20分钟后将小鼠水平放置在鼠笼内,保持鼠笼温度。1天后处死小鼠,评估小鼠体重变化及结肠长度。留取结肠组织:4%多聚甲醛固定结肠组织24小时后进行石蜡切片制备并进行HE染色评估肠炎严重程度;液氮冻存结肠分别提取RNA及蛋白质,以评估结肠炎症因子及屏障蛋白水平。4.给予束缚应激及HPA轴激活模拟组的小鼠腹腔注射糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor,GR）抑制剂RU486,验证束缚应激及HPA轴激活对淋巴细胞的作用是否是由GR介导。5.提取野生型小鼠结肠LPL,给予不同浓度的DXMS进行培养,使用流式细胞技术分析DXMS对LPL的直接作用。6.给予IL-13/SATA6通路抑制剂。在束缚应激及HPA轴激活模拟组小鼠同时给予小鼠IL-13/SATA6通路抑制剂（RCM-1,1.7mg/Kg）腹腔注射,连续7天。7天后给予1%OXA100ul/只灌肠,1天后处死小鼠,评估小鼠体重变化及结肠长度。留取结肠组织:4%多聚甲醛固定结肠组织24小时后进行石蜡切片制备并进行HE染色评估肠炎严重程度;液氮冻存结肠分别提取RNA及蛋白质,以评估结肠炎症因子及屏障蛋白水平。研究结果:1.流式分析显示:相较与对照组小鼠,焦虑模型小鼠结肠ILC2分泌IL-5/IL-13的能力明显上升,而Th2及NKT细胞分泌功能并无明显变化。2.相较于对照组,HPA轴激活模拟组小鼠结肠ILC2分泌IL-5/IL-13显著增多,并且Th2及NKT细胞功能并无明显改变。3.相较于对照组小鼠,HPA轴激活模拟组小鼠在给予1%OXA灌肠后体重下降更明显,结肠长度更短,结肠病理评分更高,结肠炎症因子TNF-α及IL-6水平更高,屏障蛋白ZO-1及Occludin表达量更低。4.RU486腹腔注射不能消除束缚应激或模拟HPA轴激活小鼠结肠ILC2功能激活的现象。5.体外实验中DXMS可以呈剂量依赖性的抑制ILC2分泌IL-5/IL-13的功能。6.相较于未接受给予RCM-1注射的小鼠,束缚应激及模拟HPA轴激活组小鼠在给予RCM-1注射后体重损失更少,结肠长度更长,结肠病理评分更低,结肠炎症因子TNF-α及IL-6水平更低,屏障蛋白ZO-1及Occludin表达量更高。研究结论:1.焦虑引起的HPA轴过度激活可以上调结肠ILC2分泌IL-5/IL-13并加重OXA诱导的结肠炎2.阻断IL-13/SATA6信号通路可以逆转束缚应激以及DXMS注射引起的肠炎加重。