Small RNAs 中的 microRNAs（miRNAs）和 trans-acting siRNAs（tasiRNAs）在植物生长发育、胁迫响应等多种生理生化过程中发挥重要作用。近年来,高通量测序产生了大量的small RNAs序列,而采用转基因方法表达人工miRNAs（artificial miRNAs,amiRNAs）来研究miRNAs的功能费时费力。本研究对中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）载体的构建和amiRNAs前体的扩增进行了简化,利用athmiR319骨架成功在本氏烟草中建立了small RNAs超表达体系,并对small RNAs超表达体系进行了优化,最终选择athmiR390骨架用于后续研究。主要研究结果如下:1.将分别含有TYLCCNV组分1.7A和2mβ的pGEM-1.7A和pBinPLUS-2mβ-Sub两个载体整合为一个载体pBinPLUS-1.7A-2mβ-Sub（命名为p1.7A+2mβ）,可以通过一步双酶切将目的片段构建到该载体中,大大缩减了载体构建过程,并进一步通过TYLCCNV-PDS和TYLCCNV-35S载体验证了该载体具有高侵染效率。2.设计靶向报告基因PDS的amiRPDS,以athmiR319为骨架,构建了 TYLCCNV-amiRPDS（319L）载体。农杆菌侵染本氏烟两到三周后,烟草叶脉处出现不连续的光漂白现象,验证了 TYLCCNV用于建立small RNAs超表达体系的可行性。3.通过设计引物将miRNA骨架上的原始miRNA替换为amiRNA,使原来需要三轮PCR扩增amiRNA前体的过程简化为一轮PCR,极大的方便了 amiRNA前体的扩增过程。4.选择 athmiR319、slymiR159 和 athmiR390 骨架,分别构建了 TYLCCNV-am iRPDS（319）、TYLCCNV-amiRPDS（159）和 TYLCCNV-amiRPDS（390）三个不同 amiRPDS 骨架的超表达载体。虽然利用三种骨架都能在烟草中超表达amiRPDS,使叶脉产生光漂白现象,且表型能持续一个月以上,但RT-qPCR分析发现athmiR390骨架能产生更多的amiRPDS,因此后续研究中使用athmiR390骨架。5.设计靶向本氏烟内源基因Su的amiRSu与靶向PCNA的amiRPCNA,构建了 TYLCCNV-amiRSu和TYLCCNV-amiRPCNA载体。农杆菌侵染本氏烟后分别出现叶脉黄化现象和顶端停止生长的表型。RT-qPCR分别检测到成熟的amiRSu和amiRPCNA及其前体,并且Su与PCNA基因都分别明显下降,说明利用TYLCCNV建立的small RNAs超表达体系可以作为有效的沉默内源基因的工具。6.构建TYLCCNV-amiR156载体,农杆菌侵染烟草后,叶片出现卷曲的表型,RT-qPCR检测到miR156升高30倍,其两个靶基因TC1 7947和TC24007表达量都显著降低。另外,TYLCCNV-amiR396载体侵染烟草后,植株变得矮小,RT-qPCR检测到miR396升高2倍,其靶基因GRF3表达量显著下降。这些结果说明利用TYLCCNV建立的small RNAs超表达体系可以作为有效的研究内源miRNAs功能的工具。7.选择拟南芥TAS3 5’D8（+）,构建TYLCCNV-5’D8（+）载体,农杆菌侵染烟草后,叶片卷曲并偏向茎。RT-qPCR分别检测到成熟的5’D8（+）,并且其靶基因ARF3,ARF4表达量显著下降。这些结果说明利用TYLCCNV建立的small RNAs超表达体系可以作为有效的研究内源tasiRNAs功能的工具。