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前言2007年,在世界范围内,胃癌仍然是排在第四位的常见恶性肿瘤,估计有100万的新发病例,其中将近70%发生在发展中国家。通常,在亚洲、部分南美国家和一些非洲国家,胃癌的发病率是最高的。在男人和女人的疾病死亡原因中,胃癌分别排在第二位和第四位。2007年,全球范围内大约有80万人死于胃癌。我国胃癌平均年死亡率约为25.2/10万人口。目前,胃癌的主要治疗措施是手术、化疗和放疗,通常是两种或多种方法相结合。但是,除非早期发现,胃癌难以治愈。在美国,胃癌的5年生存率为24%,如果早期发现,将会提高到61%。采用两种或几种标志物联合检测,有利于提高胃癌的早期诊断率,增进疗效、判断预后和检出复发。目前,CEA和CAl9-9是胃癌的两个主要的肿瘤标志物。发现新的肿瘤标记物是肿瘤的研究方向之一。CD97分子是表皮生长因子二类七次跨膜受体(EGF-TM7)家族成员之一,拥有独特的杂交结构,N-末端含有3个表皮生长因子(EGF)样功能区,通过粘蛋白样茎区与七次跨膜受体(TM7)偶联。在正常组织中,除小神经胶质细胞以外,CD97只能在巨噬细胞和树突状细胞,以及一些T、B淋巴细胞中丰富表达。如今,CD97被发现在一些上皮性癌组织中丰富表达,如甲状腺、胃肠、胰腺导管和口腔鳞状细胞癌。不同的证据表明,CD97在肿瘤的去分化、迁移、浸润和转移中发挥重要作用。然而,CD97对胃癌细胞生物学特性的影响及其内在机制仍然有待于阐明。第一章CD97-siRNA转染对人胃癌细胞株MKN45增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响目的:设计合成有效的CD97-siRNA,体外转染胃癌细胞株,观察CD97表达变化及其对体内、外胃癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。方法:1.采用人胃癌细胞株MKN45,针对CD97基因设计siRNA,采用化学法合成,筛选出最有效的CD97-siRNA。2.CD97-siRNA转染胃癌细胞48小时后,用RT-PCR检测CD97基因在mRNA水平表达的变化,72小时后用Western blot和免疫细胞化学方法检测CD97基因在蛋白水平表达的变化,并用MTT法和流式细胞术检测胃癌细胞增殖、凋亡的变化,用细胞迁移和侵袭试验检测胃癌细胞迁移和侵袭能力的变化。3.15只裸鼠随机分为3组,每组5只,分别接种转染siRNA-CD97细胞(抑制组),接种转染阴性对照siRNA-CD97细胞(阴性对照组),接种未转染细胞(正常对照组)。接种4周后,观察各组成瘤情况,比较成瘤率。结果:1.CD97-siRNA转染48小时后,RT-PCR方法检测结果表明CD97在mRNA水平表达下降70.12%;72小时后,Western blot方法检测结果表明CD97在蛋白水平的表达下降66.35%。2.CD97-siRNA转染72小时后,MTT法检测结果显示,与未转染组相比,细胞增殖率下降52.45%;流式细胞术检测结果显示,G1期细胞数量在未转染组、阴性对照组和CD97-siRNA转染组分别是14.48±3.45%、15.33±2.13%和39.79±3.05%,S期细胞数量分别是64.17±3.36%、60.35±5.21%和28.56±1.33%,出现G1→S期阻滞;同时,细胞凋亡率在未转染组、阴性对照组和CD97-siRNA转染组分别是7.24±0.35%、6.88±0.58和28.18±0.39%。3.CD97-siRNA转染72小时后,迁移和侵袭实验结果显示CD97-siRNA转染组迁移和侵袭细胞相对于未转染组分别下降了62.54±11.32%和67.13±14.03%。4.正常对照组和阴性对照组所有裸鼠均有瘤体形成,平均瘤重分别为5.255±0.571克和5.218±0.547克。CD97-siRNA转染组瘤体平均瘤重2.125±0.232克,与正常对照组相比有显著性差异(p<0.05),抑瘤率为58.1%。结论:1.CD97蛋白的表达强弱可以作为临床上判断胃癌细胞增殖、转移和侵袭能力的标志物之一,该分子可能成为抑制胃癌复发和转移的重要靶点;2.RNAi技术可以用于抑制CD97基因的表达;3.CD97-siRNA转染有望用于胃癌的基因治疗。第二章CD97-siRNA转染对胃癌细胞株MKN45生物学特性影响的分子机制的初步研究目的:研究CD97-siRNA转染诱导MKN45细胞G1期阻滞、细胞凋亡和抑制细胞体外迁移、侵袭能力的分子机制。方法:1.Western blot法检测CD97-siRNA转染后对胃癌细胞内细胞周期调节蛋白CyclinD1、CDK4和p27表达的影响。2.Western blot法检测CD97-siRNA转染后对胃癌细胞内凋亡调节因子Caspase家族表达的影响。3.Western blot法检测CD97-siRNA转染后对胃癌细胞内凋亡因子Bid、Bad、Bcl-2和Bcl-X_L表达的影响。4.Western blot法检测CD97-siRNA转染后对胃癌细胞MMP-7和TIMP-1表达的影响。5.Western blot法检测CD97-siRNA转染后对胃癌细胞PI3K/AKT表达的影响。结果:1.Western blot法检测结果表明:与未转染组和阴性对照组相比,CD97-siRNA转染72h后胃癌细胞Cyclin D1、CDK4的表达明显下调,而p27的表达明显上调。2.Westernblot法检测结果表明:与未转染组和阴性对照组相比,CD97-siRNA转染72h后胃癌细胞procaspase-9、-3的表达水平明显下降,cleaved-caspase-3的表达明显上升,而procaspase-8的表达无明显变化。CD97-siRNA是通过内源性途径诱导凋亡的。3.Western blot法检测结果表明:与未转染组和阴性对照组相比,CD97-siRNA转染72h后胃癌细胞Bcl-2的表达显著性下调,Bad的表达明显上调,Bcl-xl和Bid的表达无明显变化。4.Western blot法检测结果表明:与未转染组和阴性对照组相比,CD97-siRNA转染72h后胃癌细胞TIMP-1的表达明显上调,而MMP-7的表达明显下调。5.Western blot法检测结果表明:与未转染组和阴性对照组相比,CD97-siRNA转染72 h后胃癌细胞PI3K和AKT的磷酸化水平降低,这表明CD97分子可能是通过PI3K/AKT信号通路发挥作用。结论:1.CD97受体可能是通过PI3K/AKT信号通路发挥作用的。2.CD97-siRNA转染下调CD97分子的表达,PI3K及AKT的活性降低,进而上调p27、Bad、TIMP-1蛋白的表达,下调cyclin D1、CDK4、Bcl-2、MMP-7的表达,通过内源性凋亡途径活化caspase-3,从而抑制胃癌细胞的增殖、促进细胞凋亡并抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭。