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研究目的:骨质疏松症是一种沉默性骨代谢疾病,表现为骨量的降低和骨结构的恶化,它可以显著提高个体的骨折风险并给患者带来沉重的经济负担,尤其对于65岁以上的老年人,严重的骨质疏松会导致骨折给患者带来残疾的风险。骨重建中成骨前体细胞的主要来源是骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),对其进行调控可以影响成骨及成脂的分化。CKIP-1是酪蛋白激酶相互作用蛋白1,它是成骨的负调控因子,敲除CKIP-1可导致Smurf1活性下降,MEKK2蛋白水平、磷酸化JNK及磷酸化c-Jun水平均上调,从而使JNK-AP-1通路活性上调,使成骨能力升高。然而CKIP-1在MSCs调控骨分化方面的作用仍不清楚。本实验以CKIP-1基因敲除小鼠的骨量增加为入手点,首先探讨增龄性小鼠的繁育性能及生长发育差异;其次,观察了在体外培养的小鼠MSCs中CKIP-1基因缺失对干细胞的生物学特性影响,比较了小鼠体内及体外成骨差异;最后,初步研究了炎症微环境条件下增龄性变化对CKIP-1的表达及体外成骨能力的影响,从而为骨质疏松症的防治提供理论和实验依据。研究方法:1.建立CKIP-1基因敲除小鼠繁育体系,采用聚合酶链式反应(Polymerase chainreaction,PCR)技术对扩群子代小鼠基因型进行鉴定。测定CKIP-1基因敲除小鼠与C57BL/6J野生型小鼠在繁育性能及体重,尾长的变化,分析基因敲除小鼠的生长发育情况。2.采用全骨髓培养法分离培养WT(CKIP-1+/+)和KO(CKIP-1-/-)小鼠的MSCs,行MTT实验及克隆实验比较两组小鼠MSCs的增殖能力,成骨实验(茜素红染色,ALP染色,实时定量PCR)、成脂实验(油红O染色)检测两组细胞的多向分化能力,流式细胞术鉴定MSCs表面标记分子。3.采用Micro-CT机扫描并重建2月龄和18月龄的WT和KO小鼠股骨的骨小梁形态,观察骨质影像学相关参数的差异,并分析骨含量的异同。4.采用实时定量PCR技术、Western blot方法分别对2月龄和18月龄的C57BL/6J野生型小鼠进行体内和体外的CKIP-1表达,以研究CKIP-1在体内与体外的表达异同。5.分别对2月龄和18月龄的C57BL/6J野生型小鼠注射IL-1β,采用实时定量PCR、Western blot检测CKIP-1的表达差异,采用Micro-CT检测两组小鼠骨含量差异,初步探讨CKIP-1与炎症之间的关系。结果:1.成功建立CKIP-1基因缺失小鼠的繁育体系,采用PCR扩增实验进行基因鉴定,KO小鼠不表达CKIP-1结构中的3号外显子,选取同窝同性别的WT及KO小鼠用于后续实验。两组小鼠出生至第18个月,繁育性能和鼠尾长度并没有明显差异。体重方面:从出生到第18个月,KO小鼠与WT小鼠体重在2月龄时无明显差异(P>0.05),随着年龄的增长,在第12月时WT小鼠的平均体重约为33g,而KO组小鼠的平均体重约为39g(P<0.05),到第18月时KO组小鼠的体重与WT组相差11g(P<0.05)。2.利用小鼠股骨分离培养WT和KO小鼠的MSCs,KO小鼠的MSCs形态类似成纤维细胞样,以长梭形为主,可形成均匀集落,流式细胞仪鉴定其高表达间充质来源细胞表面标记CD90、CD44、CD106。使用KO及WT小鼠第三代(P3)细胞行体外成骨诱导,7天后行ALP染色,胞质内细胞颗粒增多,21天后行茜素红染色,出现红色阳性的矿化结节,胞质内充满颗粒,细胞呈集落样生长,细胞间有大量的矿化基质形成。成骨诱导后,KO小鼠MSCs成骨能力强于WT(P<0.05)。成骨诱导3天后,提取细胞总RNA,使用实时定量PCR检测成骨、成脂相关基因的表达,KO组OCN、Runx2、PPAR-γ的表达较WT组均增多(P<0.05)。成脂诱导21天后显微镜下观察可见细胞立体感增强,细胞内出现小脂滴,细胞由长梭形变为圆形或多边形排列,进行油红O染色显示有大量脂质沉淀,油红O染色定量结果显示,行成脂诱导后,KO组成脂能力强于WT组(P<0.05),且KO小鼠MSCs脂滴多于WT小鼠。3.分别对2月龄和18月龄的WT及KO小鼠的股骨行Micro-CT扫描,结果显示在2月龄小鼠中,WT组小鼠的骨体积分数(BV/TV)、特定骨表面积(BSA/BV)、骨小梁数目(TB.N)、骨小梁间隙(TB.Sp)与KO组小鼠无明显差异(P>0.05),而在18月龄小鼠中,KO小鼠的骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数目(TB.N)较WT小鼠增高(P<0.05),特定骨表面积(BSA/BV)、骨小梁间隙(TB.Sp)较WT小鼠降低(P<0.05)。4.实时定量PCR及Western blot结果显示在体外培养的2月龄和18月龄野生型小鼠MSCs中CKIP-1的表达无显著性差异(P>0.05),行成骨诱导实验后,CKIP-1在两组中的表达亦无显著性差异(P>0.05)。但实时定量PCR显示,CKIP-1在体内获得的骨髓中的表达为18月龄的小鼠比2月龄小鼠高约4.3倍(P<0.05),Western blot显示18月龄小鼠CKIP-1表达高于2月龄小鼠(P<0.05)。5.从2月龄和18月龄野生型小鼠股骨中提取MSCs,在体外加入IL-1β后培养,实时定量PCR结果显示,无论在2月龄还是18月龄小鼠组中,加入IL-1β均可增强CKIP-1的表达(P<0.05);同时,Western blot结果亦显示加入IL-1β后,可增加CKIP-1的表达(P<0.05)。为进一步观察炎症在小鼠体内是否影响CKIP-1的表达,我们对2月龄小鼠进行IL-1β腹腔注射,一周2次,对照组注射同等剂量PBS,3个月后取两组小鼠的骨髓对CKIP-1表达进行分析,实时定量PCR结果显示:IL-1β注射组的CKIP-1表达比对照组高3.2倍(P<0.05),Western blot结果显示IL-1β注射组的CKIP-1表达比对照组高(P<0.05)。Micro-CT结果显示:IL-1β注射组小鼠的骨体积分数及骨密度较对照组为低(P<0.05)。结论CKIP-1在骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化可能起到重要的调节作用,小鼠增龄性变化过程中炎症可能会增强CKIP-1的表达,从而影响MSCs向成骨方向分化。